04-19-2012, 05:36 PM
2. Một số ứng dụng của phản ứng PCR trong vi sinh vật
Dựa trên nguyên tắc khuyếch đại đoạn gen đặc hiệu, hiện nay hầu như tất cả các vi sinh vật gây bệnh đều có thể tìm được nhờ PCR. Sau đây là một số ứng dụng điển hình:
2.1. Dùng PCR để chẩn đoán những vi sinh vật chưa nuôi cấy nhân tạo được hoặc nuôi cấy rất khó khǎn:
- Các xoắn khuẩn: tất cả các xoắn khuẩn đều khó nuôi cấy.
Tác nhân gây bệnh giang mai (Treponema pallidum), hiện nay vẫn chưa nuôi cấy nhân tạo được. Người ta có thể dùng nước ối từ mẹ làm bệnh phẩm cho PCR (1). Nhờ vậy, giang mai bẩm sinh có thể được chẩn đoán rất sớm.
- Các tác nhân gây bệnh đường sinh dục: Tác nhân gây bệnh lậu và các viêm niệu đạo sau lậu để khó nuôi cấy. Neisseria gonorrhoeae (4) và các tác nhân thường gây viêm niệu đạo sau lậu (Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum và Mycoplasma genitalium) đã có thể đồng thời tìm được trong một ống PCR duy nhất với bệnh phẩm là nước tiểu (5). Điều này không những mang lại lợi ích thiết thực cho bệnh nhân mà còn góp phần đắc lực cho nghiên cứu, tìm hiểu, đánh giá tình hình bệnh một cách sát thực hơn, do trước đây không có điều kiện nuôi cấy tìm cǎn nguyên gây bệnh.
- Vi khuẩn lao:
Mycobacterium tuberculosis không phải là quá khó nuôi cấy; tuy vậy, chúng mọc rất chậm (thời gian nhân đôi từ 14 - 15 giờ, so với E. coli, khoảng 20 phút). Khoảng 2 tháng sau khi nuôi cấy mới nhìn thấy khuẩn lạc lao. Vì vậy, giá trị phục vụ lâm sàng của phương pháp nuôi cấy bị hạn chế rất nhiều. Phương pháp nhuộm soi từ bệnh phẩm thì có độ nhạy rất kém (phải có trên 10[sup]5[/sup] vi khuẩn/ml đờm mới cho kết quả dương tính).
PCR đã góp phần đắc lực giải quyết việc này. Nó có thể cho kết quả trong vòng 1 - 2 ngày với độ nhạy gấp khoảng 10.000 lần so với các phương pháp cổ điển. Vì vậy, có thể chứng minh được sự có mặt của vi khuẩn lao trong dịch não tuỷ, nước tiểu và các loại bệnh phẩm chứa ít vi khuẩn mà trước đây chẩn đoán rất khó khǎn.
Ngày nay, người ta còn dùng PCR để xác định các đột biến kháng Rifamicin (dấu hiệu rất có giá trị để coi một M. tuberculosis là đa đề kháng) ở gen rpoB. Nhờ vậy, những biện pháp điều trị phù hợp được áp dụng một cách kịp thời; điều đó mang lại lợi ích không nhỏ cho bệnh nhân và cộng đồng, vì rằng những chủng vi khuẩn lao đa đề kháng đã được hạn chế tung ra môi trường bên ngoài.
- Helicobacter pylori (HP): HP hiện đang là một trong những vấn đề thời sự của Y học thế giới vì vai trò quan trọng của nó trong các bệnh lý viêm, loét và ung thư dạ dày.
Tuy vậy, nuôi cấy HP rất khó. PCR đã được dùng để tìm HP trực tiếp từ mảnh sinh thiết dạ dày, hoặc tìm các gen (VacA, CagA) liên quan tới độc tính của nó. Nhờ PCR, người ta còn biết được sự phân bố của các chủng HP khác nhau trên các vùng địa lý khác nhau hoặc các chủng HP đặc biệt liên quan mật thiết đến những tình trạng bệnh lý nhất định.
- Các vi khuẩn khác như Coxiella burnetti với mảnh 438-bp của gen mã hoá cho một protein 27kDa của màng ngoài; Salmonella typhi với mảnh 343-bp mã hoá cho protein lông và 599-bp mã hoá cho kháng nguyên Vi; Pseudomonas pseudomallei (nay là Burkholderia pseudomallei) với mảnh 517-bp của 16S ARNr cũng đã được khuyếch đại thành công bằng PCR.
- Amib: Dùng PCR để tìm đoạn gen mã hoá cho một protein 30.000 Mdal liên quan tới độc tính của Entamoeba histolytica, người ta có thể phân biệt được amíp gây bệnh và amíp không gây bệnh (6).
- Virus: Virus viêm gan B (7,8), HIV, virus thuỷ đậu, virus Herpes simplex, Papillomavirus, Cytomegavirus và Enterovirus đã được chẩn đoán thành công bằng PCR.
Đối với HIV, những tài liệu đã dẫn cho thấy PCR cho kết quả dương tính sớm hơn các dấu hiệu biến đổi về miễn dịch từ 3 - 6 tháng. Đặc biệt là kỹ thuật này cho phép chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh, khi mà các kháng thể kháng HIV ở trẻ lúc này, có thể, chỉ đơn thuần là do từ mẹ truyền sang.
2.2. Xác định độc tố của vi sinh vật:
Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli, và gần đây, các gen elta và elfB của E.coli sinh độc tố ruột (enterofoxigenic Escherichia coli, ETEC); vt1 và vt2 của E. coli gây chảy máu đường ruột (enterohemorrhagic Escherichia coli; EHEC); eaeA và bfpA của E. coli gây bệnh đường ruột (enteropathogenic Escherichia coli; EPEC); ial của E.coli xâm nhập đường ruột (enteroinvasive Escherichia coli; EIEC) và Shigella đã được khuyếch đại bằng PCR nhằm chẩn đoán phân biệt giữa các loại Escherichia coli gây tiêu chảy.
PCR khuyếch đại các gen nói trên đã thay thế hoặc bổ sung cho các thử nghiệm kinh điển có độ nhậy và độ đặc hiệu kém hơn hoặc là thay thế cho các kỹ thuật phức tạp hơn.
Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CT), (CT, cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo trong cơ chế gây bệnh của chúng. PCR đã được dùng khuyếch đại đoạn gen mã hoá cho CT; nhờ đó, có thể phân biệt một cách chắc chắn Vibrio cholerae gây bệnh tả thực sự với các Vibrio cholerae khác, thuộc các nhóm huyết thanh không gây bệnh tả (trước đây gọi là các Vibrio không ngưng kết; nonagglutination, NAG).
Clostridium difficile đã được định loại thông qua xác định các loại độc tố riêng biệt của chúng bằng PCR.
2.3. Xác định vi khuẩn ngoài môi trường:
Các vi khuẩn khó nuôi cấy và/hoặc thường có mặt ngoài môi trường có thể được tìm trực tiếp bằng PCR, ví dụ như các Legionella, Salmonella, Shigella và Vibrio cholerae.
Nói tóm lại, dùng PCR để tìm tác nhân gây bệnh đã được áp dụng rất rộng rãi. PCR có lợi thế lớn là nhanh (thời gian cần thiết cho chẩn đoán tính bằng "giờ" so với các kỹ thuật kinh điển phải tính bằng "ngày"), nhạy (độ nhạy rất cao, chỉ cần từ 10 - 1000 tế bào vi khuẩn, tuỳ theo kỹ thuật, là đủ) và độ đặc hiệu cũng rất cao. Nhờ vậy, bệnh được chẩn đoán nhanh hơn và chính xác hơn.
Giá trị chẩn đoán bệnh của PCR đặc biệt trong những trường hợp vi sinh vật không nuôi cấy được hoặc nuôi cấy rất khó khǎn, tốn kém; hoặc kết quả nuôi cấy rất chậm, hoặc ở những bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi vào viện, vì rằng PCR không nhất thiết đòi hỏi phải có vi sinh vật sống.
Tuy vậy,cho đến nay, do những điểm hạn chế của nó (như đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên vật liệu riêng, đắt tiền; cán bộ kỹ thuật phải có trình độ nhất định; kỹ thuật thực hiện còn phức tạp), PCR chỉ bổ sung chứ không thay thế hẳn được phương pháp chẩn đoán kinh điển khác.
2.4. Định loại (identification) vi khuẩn
Sau khi phân lập được vi khuẩn, PCR góp phần quan trọng trong định loại chúng.
Đối với từng vi khuẩn cụ thể, qui trình cho PCR với bệnh phẩm từ lâm sàng thường giống với bệnh phẩm là vi khuẩn thuần. Tuy vậy, việc chuẩn bị ADN mẫu (template) từ vi khuẩn thuần cho PCR rất đơn giản: chỉ cần đun sôi cách thuỷ huyền dịch vi khuẩn trong 10 phút rồi thu lấy dịch nổi sau ly tâm loại bỏ tế bào là đủ.
2.5. Phân loại (classification) vi khuẩn
Nhờ khuyếch đại những đoạn gen phụ trách ARNr 16S, người ta có thể so sánh mối quan hệ gần gũi hay xa nhau giữa các vi khuẩn, góp phần phân loại vi khuẩn chi tiết hơn và chính xác hơn.