HBV genotype Real-time PCR

[VuBaVietPhuong]

HBV genotype Real-time PCR

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Xác định genotype của virus viêm gan B (HBV) trong máu.

2. Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật Real-time PCR.

II. CHUẨN BỊ

1.Người thực hiện

- Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

2.Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

2.1.Trang thiết bị

- Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

- Bộ lưu điện

- Máy ủ nhiệt

- Máy ly tâm dung cho tube 0,2 ml

- Máy ly tâm 25000 x g

- Tủ lạnh 2oC - 8oC

- Tủ âm sâu (-20oC) hoặc (-70oC) (nếu có)

- Máy vortex

- Tủ an toàn sinh học

- Micropipettes các thể tích từ 5 ul - 1000 ul.

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao

Bông

Dây garô

Cồn

Bơm kim tiêm

Panh

Khay đựng bệnh phẩm

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Tube đựng bệnh phẩm

Găng không có bột tal

Sinh phẩm chẩn đoán

Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng

Kít tách DNA

Ngoại kiểm (nếu có)*

Ependoff 1,7ml

Ependoff 0,2ml

Đầu côn 10 µl có lọc

Đầu côn 30 µl

Đầu côn 200 µl có lọc

Đầu côn 1 ml có lọc

Ethanol BDH

Water-DEPC Treated

Giấy thấm

Giấy xét nghiệm

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Bút viết kính

Bút bi

Mũ

Găng tay

Găng tay xử lý dụng cụ

Quần áo bảo hộ

Dung dịch nước rửa tay

Cồn sát trùng tay nhanh

Dung dịch khử trùng

Khăn lau tay

* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

3.Bệnh phẩm

Huyết thanh, huyết tương hoặc máu toàn phần

4.Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

1.Lấy bệnh phẩm

- Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (xem phụ lục 3)

- Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu (xem phụ lục 6).

2.Tiến hành kỹ thuật: Bộ sinh phẩm HBV genotype

2.1.Tách chiết DNA

2.2.Thực hiện phản ứng real-time PCR

- Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

- Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.

- Cho chứng +, chứng - hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube HBV Genotype A rPCR Mix, HBV Genotype B rPCR Mix và HBV Genotype C rPCR Mix

- Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình real-time PCR.

- Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.

- Chọn màu “FAM” cho tất cả các mẫu, chứng dương và chứng âm.

- Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động

- Lưu file dữ liệu vào máy tính.

- Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

1. Điều kiện của phản ứng

- Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vượt quá tín hiệu nền với cả 3 genotype.

- Chứng âm có đường biểu diễn thẳng và không vượt qua tín hiệu nền.

2. Phân tích mẫu

- Mẫu có đường biểu diễn dương tính tại vị trí tương ứng với genotype nào thì kết luận mẫu nhiễm genotype đó. Một mẫu có thể đồng nhiễm nhiều genotype.

- Mẫu có đường biểu diễn âm tính với tất cả các genotype thì kết luận: “Mẫu nhiễm HBV genotype khác ngoài 3 genotype A, B, C” (vì mẫu đã được xác định dương tính với HBV trước đó).

3. In đồ thị kết quả

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Tất cả các mẫu đều dương tính kể cả chứng âm.

- Nguyên nhân 1: Lô thí nghiệm bị ngoại nhiễm DNA hoặc sản phẩm PCR từ môi trường của khu vực thao tác hoặc nhiễm chéo giữa các mẫu.

Khắc phục: Chiếu UV và vệ sinh khu vực thao tác bằng nước Javel để khử nhiễm. Tiến hành lại thí nghiệm thật cẩn thận.

- Nguyên nhân 2: Kit bị ngoại nhiễm DNA hoặc sản phẩm PCR trong quá trình sử dụng.

Khắc phục: Thay kit mới và thực hiện quá trình như hướng dẫn ở nguyên nhân 1.

Trường hợp này không thể lấy kết quả, phải khắc phục và tiến hành lại thí nghiệm.

Theo quyết định số 26 /QĐ-BYT ngày 03 tháng 01 năm 2013

Kit bao giờ cũng có chứng nội nữa vì vậy bao giờ cũng phải chọn trình tự đọc cho chứng nội kèm theo kên đọc trình tự đích