Điện di LDL/HDL Cholesterol

[tuyenlab]

ĐIỆN DI LDL/HDL - CHOLESTEROL

 
I. NGUYÊN LÝ
 

Điện di trên gel agarose để tách các thành phần LDL, VLDL, HDL cũng như chylomicron dựa trên độ tích điện và khối lượng phân tử của các thành phần. Các thành phần được phát hiện bằng phản ứng enzym so màu sau đây:

 

Cholesterol esterase

Cholesterol ester + H2O <------------------------------------->    cholesterol tự do + acid béo

 

Cholesterol dehydrogenase

Choleterol tự do + N D    <------------------------------->    cholesterone + NADH + H+

 

NADH + PMS <------------------> PMS khử + NAD 

PMS khử + NBT <------------------------>MS + NBT khử

II.CHUẨN BỊ
 
1. Người thực hiện
 
Bác sĩ, Cử nhân, hoặc kỹ thuật viên được tập huấn sử dụng máy
 
2. Phương tiện, hóa chất
 
2.1. Phương tiện: Máy Hydrasys của hãng Sebia Pháp
 
2.2. Hóa chất: Được cung cấp bởi hãng đặt máy, gồm
 

+ Agarose gel: Gel có chứa agarose 0,65g/dL; kiềm đệm pH 8,9±0,1. Lưu trữ các gel theo chiều ngang trong bì ở nhiệt độ phòng (15-30oC) hoặc lạnh (2 -8oC), ổn định cho đến ngày hết hạn ghi trên gói kit. Tránh lưu trữ gần cửa sổ hoặc một nguồn nhiệt.

 
Loại bỏ khi:
 
Dạng tinh thể hoặc dạng tủa trên bề mặt gel hoặc kết cấu gel trở nên rất mềm.
 
Sự phát triển của vi khuẩn hay nấm mốc
 
Số lượng bất thường của chất lỏng ở mặt trong hộp gel
 

+ Dung dịch đệm: chứa natri acid 0,3% khi tiếp xúc với da, hãy rửa ngay với thật nhiều nước. Lưu trữ các dải đệm theo chiều ngang trong bao bì bảo vệ ban đầu, trong tủ lạnh (2- 8oC). Chúng ổn định cho đến ngày hết hạn ghi trên gói kit hoặc đệm nhãn gói dải. Vứt bỏ đệm dải nếu gói được mở ra và các dải khô.

+ Dung môi hòa tan cơ chất: gồm NaCl. Lưu trữ dung môi hòa tan cơ chất ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh, ổn định đến ngày hết hạn ghi trên gói bộ hoặc bề mặt lọ. Loại bỏ dung môi nếu trở nên đục do nhiễm khuẩn.

 

+ Chromogen: gồm NitroBlue Tetrazolium và Phenazine Methosulfate. Lưu trữ chromogen ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh, ổn định đến ngày hết hạn ghi trên gói kit. Loại bỏ nếu nó trở nên đục do nhiễm khuẩn.

 

+ Enzym:Mỗi lọ enzym chứa Cholesterol Esterase, Cholesterol Dehydrogenase, Nicotinamide Adenine Dinucleotide. Enzym lưu trữ trong tủ lạnh (2 – 8oC). Chúng được ổn định đến ngày hết hạn ghi trên gói kit.

 
HYDRAGEL LDL / HDL Chol
 
-    pplicator: dùng 1 lần, lưu trữ ở nơi khô ráo, ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh.
 
- Giấy lọc mỏng: dùng một lần, để thấm độ ẩm quá mức khỏi bề mặt gel trước khi thực hiện mẫu. Lưu trữ các giấy tờ lọc mỏng ở nơi khô ráo, ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh.
 

- Giấy lọc dày: dùng một lần, để thấm dung dịch thừa ra khỏi bề mặt gel trước khi rửa. Lưu trữ ở nơi khô ráo ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh.

 
3. Người bệnh
 

Gồm những người bệnh khám và điều trị tại bệnh viện được các bác sĩ lâm sàng chỉ định.

 
4. Phiếu xét nghiệm
 
Theo mẫu quy định của bệnh viện và Bộ Y tế
 
Cần ghi đầy đủ thông tin về tên, tuổi, giới tính, khoa phòng, chẩn đoán, ghi rõ chỉ định xét nghiệm, thời gian lấy mẫu, loại mẫu…
 
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
 
1. Lấy bệnh phẩm
 

Dùng Huyết thanh, lấy mẫu ở những người bệnh nhịn ăn ít nhất 12 giờ. Bảo quản mẫu 2-8oC, thực hiện càng sớm càng tốt sau khi thu thập và < 3 ngày. Không làm đông lạnh các mẫu. Không sử dụng các mẫu được thu thập trên ống heparin.

 
2. Tiến hành kỹ thuật
 
-   Bật máy HYDR SYS
 
-   Nhỏ 10µl mẫu trong từng giếng, nhỏ mẫu trong vòng 2 phút.
 
-   Đặt applicator vào buồng hút ẩm
 
-   Mẫu khuyếch tán vào những răng của applicator trong 5 phút.

-   Chọn chương trình chạy điện di trên màn hình của máy
 
-   Mở dải đệm từ gói bảo quản, mở tấm gel agarose.
 

-   Dùng giấy lọc mỏng để hấp thụ lượng dư thừa của dung dịch bảo quản. Lấy giấy ra ngay lập tức.

 

-   Nhỏ 120µl nước cất, đặt tấm gel, kết thúc ở viền dưới cùng của khung, chú ý không có bọt khí bị mắc kẹt, nước được lan truyền bên dưới toàn bộ tấm gel và gel được xếp với khung in.

 
-   Đặt điện cực vào giá đỡ ở vị trí số 3
 
Đóng nắp module và nhấn "START" trên màn hình máy.
 
Sau đó là quá trình sấy khô, rửa, nhuộm, scan và phân tích kết quả.
 
Trong mỗi lần thực hiện kỹ thuật nên thực hiện kèm1 mẫu Control.
 
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
 

Đo mật độ quang ở bước sóng 570nm, tính được nồng độ tương đối (phần trăm) giữa các dải. Các thành phần có thể khác nhau. Điều này phụ thuộc vào sự có mặt hay vắng mặt của VLDL.

Tính HDL cholesterol và nồng độ cholesterol LDL với các công thức sau đây: 

Cholesterol toàn phần (mg/dL hoặc mmol/L) x tỷ lệ phần trăm 

HDL Cholesterol toàn phần  (mg/dL hoặc mmol/L) x tỷ lệ phần trăm LDL

Các yếu tố nguy cơ khác bao gồm tuổi, tiền sử gia đình bệnh tiểu đường, bệnh mạch vành, tăng huyết áp và hút thuốc lá.

 

Người ta đã ghi nhận rằng nguy cơ các bệnh tim mạch tăng lên với sự gia tăng tỷ lệ phần trăm của lipoprotein trọng lượng phân tử thấp trong huyết thanh.  Mặt khác, Lipoprotein trọng lượng phân tử cao (HDL) chống xơ vữa động mạch bằng cách loại bỏ cholesterol từ các mô gan là cơ quan duy nhất có thể dị hóa và bài tiết. Thành phần lipid, như cholesterol, có thể đóng vai trò khác nhau tùy thuộc vào lipoprotein đã vận chuyển nó. Vì vậy, để đánh giá nguy cơ bệnh tim của một rối loạn lipoprotein máu, là cần thiết để định lượng cholesterol trong các phân đoạn lipoprotein, chủ yếu là LDL và HDL.

 

Nghiên cứu gần đây tại Viện Y tế Quốc gia (NIH Bethesda, Mỹ) đã chỉ ra rằng nguy  cơ  phát  triển  bệnh  xơ  vữa  động  mạch  vành  có  liên  quan  đến  tỷ  lệ  LDL cholesterol / HDL cholesterol: tỷ lệ càng cao , nguy cơ càng cao. Trong trường hợp cholesterol máu thấp hơn bình thường là điều cần thiết để điều tra sự phân bố cholesterol trong lipoprotein khác nhau trước khi quyết định bất kỳ điều trị.

 
V. SAI SÓT – XỬ TRÍ
 
-   Không sử dụng các mẫu được thu thập trên ống heparin, hoặc đã được đông lạnh
 
-   Ngày nay định lượng LDL-C và HDL-C trực tiếp trên máy sinh hóa tự động cho kết quả nhanh và chính xác hơn điện di, tuy nhiên thành phần VLDL không định lượng được nên có thể áp dụng phương pháp điện di này để tính giá trị VLDL tương đối, giúp cho các bác sĩ lâm sàng.

Theo quyết định số: 320 /QĐ-BYT ngày 23 tháng 01 năm 2014