04-17-2016, 12:04 AM
ĐIỆN DI LACTAT DEHYDROGENASE (LDH)
I. NGUYÊN LÝ
Lactat dehydrogenase (LDH) gồm 5 isoenzym. Điện di LDH nhằm phân tách các thành phần isoenzym của LDH. Điện di isoenzym LDH được thiết kế để xác định và định lượng 5 iso enzymes LDH trong huyết thanh người. LDH bao gồm năm đơn vị Isoenzym từ LDH1 đến LDH5. Mỗi isoenzym LDH được tạo thành từ bốn tiểu đơn vị (chuỗi polypeptide), có hai loại tiểu đơn vị: M ("cơ bắp") và H ("tim"). Điện di isoenzym LDH cho ra các thành phần, tên gọi và nguồn gốc các LDH như sau:
![[Image: dien%2Bdi%2Blactac.jpg]](https://lh3.googleusercontent.com/-MecVm8ws8cM/VxJgkkoUclI/AAAAAAAADbU/5mZ_KwQKjmITJGSSY1bIQWcaYFpwyf4ZACCo/s696-Ic42/dien%2Bdi%2Blactac.jpg)
Tất cả isoenzymes LDH xúc tác phản ứng thuận nghịch theo phản ứng sau:
LDH
Lactate + NAD <-----------------------> Pyruvate + NADH2
NADH2 + PMS <-----------------------> PMS khử + NAD
PMS khử + NBT <-----------------------> PMS + khử NBT
NAD: Nicotinamide Adenine Dinucleotic
PMS: Phenazine Methosulfate
NBT: Nitro Blue Tetrazolium
II.CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Bác sĩ, Cử nhân, hoặc kỹ thuật viên chuyên ngành Hóa sinh được tập huấn sử dụng máy
2. Phương tiện, hóa chất
2.1. Phương tiện: Máy Hydrasys của hãng Sebia Pháp
2.2. Hóa chất: Được cung cấp bởi hãng đặt máy, gồm:
7 mẫu trong bộ kit HYDRAGEL ISO-LDH
15 mẫu trong bộ kit HYDRAGEL ISO-LDH
30 mẫu trong bộ kit HYDRAGEL ISO-LDH
Thành phần trong mỗi bộ kit:
Agarose gel: bảo quản ở nhiệt độ phòng (15-30oC) hoặc lạnh (2-8oC). Chúng được ổn định đến ngày hết hạn ghi trên gói. Tránh lưu trữ gần cửa sổ hoặc nguồn nhiệt, không làm đông lạnh.
Dải đệm: gồm alkaline buffer pH= 8,3. Lưu trữ ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh (Mũi tên trên mặt trước của hộp hướng lên trên), chúng ổn định cho đến ngày hết hạn ghi trên gói kit, không làm đông lạnh.
Dung môi hòa tan cơ chất: gồm lithium lactate, bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh, ổn định đến ngày hết hạn ghi trên gói kit.
Cơ chất ISO-LDH: gồm NAD, NBT, PMS.
Pha cơ chất 10 phút trước khi sử dụng bằng cách thêm 2,25 mL dung môi hòa tan cơ chất vào lọ, đậy nắp, để ở nhiệt độ phòng (15-300C) trong 05 phút, sau đó trộn nhẹ nhàng.
Dung dịch kìm hãm ISO CK / LD: gồm a.acetic 5%, a.citric 0,5%.
sử dụng để làm ngừng phản ứng enzym với cơ chất sau khi ủ gel theo thời gian quy định. Bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh và ổn định đến ngày hết hạn ghi trên lọ.
Applicators: dùng để mao dẫn huyết thanh
Giấy lọc mỏng: để thấm độ ẩm thừa khỏi bề mặt gel trước khi sử dụng mẫu. Lưu trữ giấy lọc mỏng ở nơi khô ráo, nhiệt độ phòng. Giấy lọc dày: để thấm nhiều dung dịch chặn ra khỏi bề mặt gel trước khi sấy khô. Bảo quản ở nơi khô ráo, nhiệt độ phòng.
3. Người bệnh: Gồm những người bệnh khám và điều trị tại bệnh viện.
Những người bệnh nghi ngờ tổn thương gan, thận, tim
4. Phiếu xét nghiệm: Theo mẫu quy định của bệnh viện và Bộ Y tế.
Cần ghi đầy đủ thông tin về tên, tuổi, giới tính, khoa phòng, chẩn đoán, ghi rõ chỉ định xét nghiệm, thời gian lấy mẫu, loại mẫu…
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm: Chỉ dùng huyết thanh
- Lấy 2ml máu cho vào ống nghiệm không có chất chống đông. Quay ly tâm, tách lấy phần huyết thanh. Bảo quản 1 tuần ở nhiệt độ phòng, không bảo quản mẫu ở 2-8 oC. Không dùng mẫu đông lạnh hoặc mẫu vỡ hồng cầu
- Khi hoạt độ LDH > 750 IU/L, pha loãng mẫu huyết thanh bằng nước muối sinh lý để đạt được hoạt độ LDH khoảng 750 IU/L. Trộn và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
2. Tiến hành kỹ thuật
- Bật máy Hydrasys
- Lấy 10µL huyết thanh nhỏ vào mỗi giếng trên applicator, tránh lan sang giếng bên cạnh
- Đặt pplicator vào bình hút ẩm 5 phút
- Mở nắp buồng điện di và gắn điện cực vào
- Chọn chương trình điện di trên màn hình của máy
- Mở gói garose gel, dùng giấy thấm mỏng để thấm hết dung dịch bảo quản trên gel.
- Nhỏ 120µL nước cất (đối với HYDRAGEL 7 ISO CK/LD), hoặc 200 µL cho HYDRAGEL ISO CK/LD 15/30) lên 1/3 dưới của khung đặt garose gel
- Đặt tấm gel lên khung, tránh bong bóng giữa tấm gel và bề mặt khung
- Thấm hết dung dịch thừa xung quanh gel
- Chụp khung bảo vệ, đặt applicator lên trên khung đúng vị trí
- Đậy nắp buồng điện di và ấn START
- Sau khi điện di xong, lấy applicator ra khỏi buồng điện đi
- Đặt template 4 (khuôn) vào buồng ủ bên cạnh buồng điện di, dùng pipet nhỏ 2ml cơ chất ISO LDH (đối với HYDRAGEL 7 ISO CK / LD, hoặc 4 ml đối với ISO-LDH cho HYDRAGEL ISO CK / LD 15/30) vào lổ của template 4, tránh bọt khí, sau đó bấm nút start trên máy để ủ. Sau khi ủ xong loại bỏ cơ chất ISO LDH thừa bằng pipet.
- Sau đó nhỏ 2ml dung dịch nhuộm ISO LDH (đối với HYDRAGEL 7 ISO CK / LD, hoặc 4 ml đối với ISO-LDH cho HYDRAGEL ISO CK / LD 15/30), tránh bọt khí, sau đó bấm nút start trên máy để nhuộm. Sau khi nhuộm xong loại bỏ dung dịch nhuộm ISO LDH thừa bằng giấy thấm.
- Bước tiếp theo là sấy khô và scan gel lên phần mềm và phân tích kết quả (ở bước sóng 570nm).
- Trong mỗi lần chạy mẫu nên kèm theo 1 mẫu Control.
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- LDH là một enzym trong tế bào xúc tác phản ứng pyruvat <----> lactat. LDH có mặt trong hầu hết các mô của cơ thể và được giải phóng khi có tình trạng hủy tế bào.
- LDH tăng trong : tổn thương cơ, tổn thương gan, bệnh lý huyết học (tan máu, thiếu máu), tổn thương thận (suy thận, ghép thận)
- Giá trị tham khảo :
LDH toàn phần 240 – 480 U/L
LD1: 16,1 - 31,5%
LD2: 29,2 – 41,6%
LD3: 17 – 26,3%
LD4: 5,9 – 12,3%
LD5: 3,2 – 17,3%
Mỗi Labo nên thiết lập giá trị bình thường của riêng mình.
Khi phân tích kết quả nên kết hợp với tiền sử của người bệnh.
- LD1và LD2 tăng trong nhồi máu cơ tim, phẫu thuật tim, tan huyết, bệnh
- LD3 tăng và đồng thời cũng tăng LD2 và LD4 trong nhồi máu phổi, lymphomas…
- LD5 tăng trong các bệnh lý về cơ xương, bệnh gan và suy tim sung huyết.
V. SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Hoạt độ LDH trong hồng cầu cao gấp 100 lần so với hoạt độ enzym trong huyết thanh, vì vậy những trường hợp mẫu vỡ hồng cầu có thể làm kết quả không chính xác → không thực hiện.
- Liên hệ với kỹ sư để được chỉ dẫn khi kỹ thuật bị lỗi, hay chuẩn bị và bảo quản hóa chất một cách cẩn thận.
Theo quyết định số: 320 /QĐ-BYT ngày 23 tháng 01 năm 2014