Qui trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Neisseria meningitidis

[ghostnurse]

QUI TRÌNH NUÔI CẤY PHÂN LẬP VI KHUẨN Neisseria meningitidis

1. Phạm vi áp dụng: phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng từ cấp trung ương, tỉnh, thành phố.

2. Nguyên lý:
Vi khuẩn Neisseria meningitidis (não mô cầu) thuộc giống Neisseria bộ Neisseriaceae, có thể sống cộng sinh ở đường hô hấp trên (mũi-họng) của người một thời gian mà không gây triệu chứng lâm sàng. Nhiễm trùng não mô cầu chỉ xảy ra ở người, bệnh có thể diễn biến rất nặng, phổ biến nhất là viêm màng não mủ, nhiễm khuẩn huyết gây sốc nhiễm trùng nhiễm độc, có tỷ lệ tử vong cao hơn nhiều lần viêm màng não do vi khuẩn khác và lây lan thành dịch.
Ít phổ biến hơn, não mô cầu có thể di chuyển theo dòng máu tới các tổ chức khớp, phổi, van tim để gây nên viêm khớp, viêm phổi, viêm nội tâm mạc. Tuy nhiên, tỷ lệ bệnh nhân mắc thể nhiễm trùng tối cấp như vậy không nhiều, khoảng chừng 90% các trường hợp nhiễm não mô cầu thường chỉ bị nhiễm trùng khu trú vùng sau tỵ hầu, đôi khi là nhiễm khuẩn huyết song nhiễm khuẩn huyết đã được giới hạn bởi sức đề kháng của cơ thể.
Vị trí ưa thích của não mô cầu ở đường hô hấp trên của người là vùng sau của tỵ hầu, vi khuẩn có thể tồn tại ở đó vài tuần và có thể tồn tại lâu ở một số cá thể. Hãn hữu, có thể tìm thấy não mô cầu ở vùng tiết niệu-sinh dục và trực tràng.
Não mô cầu lây từ người này sang người khác qua sự tiếp xúc trực tiếp với đường hô hấp trên hoặc qua các giọt dịch dạng khí phát tán khi nói chuyện, ho, hắt hơi của người mang vi khuẩn. Não mô cầu khó tồn tại ở ngoại cảnh và người là vật chủ duy nhất.
Não mô cầu có vỏ polysaccarit (xác định được bởi phản ứng ngưng kết với các typ huyết thanh đặc hiệu) với nhiều cấu trúc kháng nguyên khác nhau, là cơ sở để phân loại não mô cầu thành 13 nhóm huyết thanh. Đại đa số bệnh não mô cầu là do chủng vi khuẩn các typ huyết thanh A, B, C, W135 và Y gây nên.
Để giám sát dịch tễ những typ huyết thanh gây bệnh dịch của vi khuẩn N.meningitidessau khi được phân lập và định danh, phản ứng ngưng kết chủng vi khuẩn với những kháng huyết thanh đặc hiệu vỏ phổ biến là các typ A, B, C, W135 và Y được thực hiện trên phiến kính hoặc bằng bộ sinh phẩm ngưng kết latex.

3. Phương pháp xét nghiệm xác định N. meningitidis (não mô cầu)
3.1. Lấy mẫu, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm:
Trong trường hợp bệnh nhân có hội chứng viêm màng não- não, cần xét nghiệm những loại bệnh phẩm sau:
- Dịch não tủy (DNT): do bác sĩ lâm sàng chỉ định và thực hiện. Thể tích dịch não tủy cần cho xét nghiệm vi sinh cần từ 1ml đến 2ml (tối thiểu 0,5ml). Dịch não tủy sau khi được lấy, không giữ ở tủ lạnh, nên giữ ở 30-350C hoặc nhiệt độ phòng (280C) và chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 1 giờ. Nếu không chuyển được ngay phải giữ dịch não tủy trong môi trường bảo quản T-I, hoặc được cấy ngay lên môi trường thạch máu động vật 5% hoặc môi trường máu chín (thạch sôcôla) và chuyển về phòng thí nghiệm.
- Máu: trong trường hợp bệnh nhân đang sốt, lấy vô khuẩn 3ml -5ml, cấy ngay theo tỷ lệ 1 phần máu trong 10 phần canh thang (canh thang Trypticase soy [TSB] hay Brain Heart Infusion [BHI] có bổ xung chất hỗ trợ vi khuẩn phát triển như 5% Fildes enrichment hoặc 5% Levinthal Base (là canh thang BHI có 20% máu cừu được xử lý ở nhiệt độ 800C trong 20 phút, ly tâm lấy dịch nổi).
Chú ý: khác với việc tăng sinh các loại vi khuẩn khác, canh thang tăng sinh não mô cầu không có SPS (sodium polyanetholesulfonate) vì chất này chống hình thành áo máu nhưng lại gây độc với não mô cầu. Để ức chế hoặc trung hòa các yếu tố kháng khuẩn của máu chỉ cần pha loãng máu với canh thang nuôi cấy ít nhất là 1/10 với trẻ em và 1/5 với người lớn.

- Tổn thương trên da: trong trường hợp có đám hoại tử trên da, dùng bơm kim tiêm sạch bơm vào tổn thương một vài giọt nước muối sinh lý vô trùng rồi hút dịch ra, hoặc cấy ngay lên thạch sôcôla hoặc được chuyển ngay về phòng thí nghiệm và nuôi cấy trong vòng 1h.
- Dịch mũi - họng: mục đích để giám sát dịch tễ, điều tra người lành mang vi khuẩn. Bệnh phẩm đường hô hấp trên được lấy bằng tăm bông hoặc hút bằng máy hút chân không áp lực thấp, ria cấy ngay (0,1ml) lên môi trường nuôi cấy (thạch máu 5% hoặc thạch sôcôla) hoặc giữ trong môi trư­­ờng vận chuyển (T-I).

*Lưu ý:
- Nhiệt độ, khí trường thích hợp cho vi khuẩn phát triển: từ 35 - 370C, khí trường có 3-5% CO2 và độ ẩm nên đảm bảo ≥ 50%.
- Nhiệt độ để giữ trong lúc vận chuyển: 30-350C, không giữ lạnh và không được để bệnh phẩm bị khô (có thể thêm vào ống giữ bệnh phẩm vài giọt dung dịch NaCl 0,9%).

3.2. Phương pháp xét nghiệm xác định não mô cầu từ bệnh phẩm
3.2.1. Phát hiện trực tiếp (Nhuộm soi trực tiếp): thường được áp dụng với dịch não tủy
Nguyên vật liệu và trang thiết bị:
+ Que cấy 1µl
+ Bộ nhuộm Gram
+ Lam kính và lamen
+ Đèn cồn
+ Kính hiển vi
+ Máy Vortex (máy trộn)
+ Máy ly tâm tốc độ từ 2000 – 15.000 vòng/ phút

Chuẩn bị tiêu bản:
*Nếu thể tích DNT > 1ml: ly tâm 2.000 vòng/20 phút hoặc 15.000 vòng/10 phút (trong trường hợp cần thực hiện phản ứng PCR).
- Dịch nổi: sử dụng trong phản ứng ngư­ng kết latex phát hiện kháng nguyên vỏ polysaccarit của não mô cầu (N. meningitidis).
- Cặn (sau ly tâm giữ lại 100 µl): sử dụng để nhuộm Gram và nuôi cấy hoặc cho các xét nghiệm khác (PCR...).
*Nếu thể tích DNT < 1ml: không cần ly tâm mà lấy 1-2 giọt nhuộm Gram (chú ý không phải dàn mỏng).
Tạo tiêu bản bệnh phẩm dịch não tủy (không cần dàn mỏng), nhuộm Gram quan sát bạch cầu đa nhân, hình thể vi khuẩn. Lưu ý, quan sát trực tiếp bệnh phẩm trước khi xử lý bệnh phẩm với hóa chất.

Nhuộm Gram:
Nhỏ lên lam kính sạch 1 giọt cặn, để khô tự nhiên, cố định trên ngọn đèn cồn (chú ý kiểm soát độ nóng của lam), nhuộm Gram theo hướng dẫn dưới đây. Quan sát dưới kính hiển vi nếu phát hiện thấy bạch cầu đa nhân trung tính và song cầu hình hạt cà phê bắt màu Gram âm nằm bên trong hoặc bên ngoài bạch cầu là dấu hiệu định hướng viêm màng não do não mô cầu.

Phương pháp nhuộm Gram
a/ Chuẩn bị thuốc nhuộm:
+ Thuốc nhuộm tím gentian:
Tím gentian, dung dịch bão hòa trong cồn 95o: 10 ml
Axit phenic 1 ml
Nước cất 100 ml
Lắc đều lọc qua giấy.
+ Dung dịch lugol:
Iod 1 g
Kali Iodua 2 g
Nước 5 ml
Nghiền tan trong cối, rồi thêm nước cho đủ 200 ml
+ Thuốc nhuộm Fucsin kiềm:
Fucsin kiềm, dung dịch bão hòa trong cồn 95oC: 10 ml
Axit phenic: 5 ml
Nước cất 100 ml
Lắc đều, lọc qua giấy.

b/ Cách nhuộm:
Dàn tiêu bản, để khô tự nhiên. Cố định tiêu bản trên phiến kính bằng cách hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn, kiểm tra độ nóng (nhẹ vừa phải trên mu bàn tay). Chú ý: nóng quá, hoặc hơ lâu, vi khuẩn sẽ biến dạng.
Đổ thuốc nhuộm tím gentian lên tiêu bản, để 1 phút, rửa nước.
Đổ dung dịch lugol lên tiêu bản, để 1 phút, hất bỏ đi.
Tẩy màu bằng cồn 90o hoặc hỗn hợp Acetone + cồn 900 (tỷ lệ 1:1) tới khi bạc màu.
Rửa qua nước.
Đổ thuốc nhuộm Fucsin lên tiêu bản, để 1 phút.
Rửa qua nước.
Thấm giấy hoặc để khô ở không khí.

c/ Đọc kết quả:
Vi khuẩn Gram dương: màu tím (tím gentian).
Vi khuẩn Gram âm: màu đỏ (đỏ Fucsin).
Hình ảnh não mô cầu: song cầu hạt cà phê bắt màu hồng đậm

3.2.2. Nuôi cấy phân lập vi khuẩn não mô cầu (N. meningitidis)
Môi trường và sinh phẩm cho nuôi cấy phân lập:
+ Môi trường thạch máu chín (sôcôla) hoặc thạch máu cừu 5% (BD BBL Co.,).
+ Canh thang tăng sinh (Trypticase soy hoặc BHI có 5% Fildes enrichment - BD BBL Co., hoặc tương đương.
+ Oxidase (tetramethyl-p-phenylenediamine hydrochloride – BD BBL hoặc tương đương).
+ Bộ môi trường CTA (Cystine Trypticase Agar): CTA không đường và CTA có chứa 1 trong 4 loại đường Maltose, Glucose (hoặc Dextrose), Lactose và Sucrose (của BD BBL CO., hoặc tương đương).
+ Bộ kháng huyết thanh A, B, C, Y, W135 (Ref: 30859602 ZL26; Wellcogen Bacterial Antigen Kit- Remel, UK hoặc tương đương).

Dụng cụ và trang thiết bị cho nuôi cấy phân lập, định danh:
+ Que cấy có vòng ăng to (10µl) và nhỏ (1µl)
+ Các loại ống nghiệm thủy tinh và nhựa (bảo quản mẫu)
+ Pipet chính xác và các loại đầu tip 10µl, 100µl
+ Máy ly tâm tốc độ từ 2000 – 15.000 vòng/phút
+ Máy trộn Vortex
+ Kính hiển vi
+ Tủ ấm thường với bình kín đốt nến hoặc tủ ấm CO2

Hình 1: tiêu bản nhuộm dịch não tủy
(bạch cầu đa nhân và các song cầu hạt cà phê nằm bên trong tế bào bạch cầu)

Hình 2: vi khuẩn N. meningitidis xếp đôi (song cầu hình hạt đậu)

Nuôi cấy dịch não tủy:
Sau khi ly tâm DNT (2.000 vòng/20 phút hoặc 3.000 vòng/10 phút), giữ lại phần ‘cặn’(100 - 200µl) để ria cấy trên thạch sôcôla hoặc thạch máu 5% và cấy vào canh thang tăng sinh:
*Cấy 0,01ml DNT sau ly tâm vào môi trường đặc (thạch sôcôla và thạch máu 5%), lấy 0,05ml nữa cấy vào 1 ống môi trư­ờng tăng sinh (canh thang Trypticase soy hoặc canh thang não tim (BHI) có bổ sung 5% Fildes enrichment- Hãng Becton Dickinson hoặc 5% Levinthal Base (là canh thang BHI có 20% máu cừu được xử lý ở nhiệt độ 800C trong 20 phút, ly tâm lấy dịch nổi). Ủ qua đêm ở 370C/5% CO2 và độ ẩm ≥ 50%.
Sau 16-24h nuôi cấy, quan sát khuẩn lạc trên môi trường thạch, nếu trên môi trường thạch âm tính, phải cấy chuyển từ ống canh thang tăng sinh sang 1 đĩa thạch máu 5% mới và/hoặc 1 đĩa thạch sô cô la mới vào các ngày thứ 2, 3 và thứ 7. Sau 7 ngày âm tính ở canh thang tăng sinh mới kết luận bệnh phẩm âm tính với não mô cầu.

Nuôi cấy máu:
Trong trường hợp bệnh nhân đang sốt, lấy vô khuẩn 3ml - 5ml, cấy ngay theo tỷ lệ 1: 5 (máu/canh thang nếu của trẻ em) và 1:10 (nếu của người lớn) (cấy vào canh thang Trypticase soy [TSB] hay Brain Heart Infusion [BHI] có bổ xung chất hỗ trợ vi khuẩn phát triển như 5% Fildes enrichment hoặc 5% Levinthal Base - là canh thang BHI có 20% máu cừu được xử lý ở nhiệt độ 800C trong 20 phút, ly tâm lấy dịch nổi) hoặc vào canh thang cấy máu thương phẩm (Bio-Rad hoặc BioMérieux Co.,). Ủ ở 370C/5% CO2 và độ ẩm ≥ 50%. Theo dõi sau ≥ 20h, nếu có biểu hiện vi khuẩn phát triển (môi trường cấy máu đục, váng...), cấy chuyển tiếp sang môi trường thạch máu cừu 5% và/ hoặc thạch sô cô la, ủ tiếp ở ở 370C/5% CO2 và độ ẩm ≥ 50% qua đêm.

Quan sát khuẩn lạc nghi ngờ: trên thạch máu cừu 5% và thạch sôcôla. Khuẩn lạc tròn vồng nhẹ, bờ đều và có màu xám (đường kính khoảng 1mm), một số chủng vi khuẩn khi cấy dày trên thạch máu có thể có màu trắng kem. Khuẩn lạc não mô cầu không gây tan huyết môi trường và không có mùi. Các khuẩn lạc có xu hướng liên kết với nhau, khi đó hơi có ánh xanh. Khuẩn lạc tan dễ dàng trong nước muối sinh lý, tuy nhiên, sau 24 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc trở nên dẻo dính là do não mô cầu tự ly giải, các chất nucleo-protêin đã thoát từ bên trong tế bào ra ngoài, lúc này nếu cấy chuyển thường thất bại vì phần lớn vi khuẩn đã chết.

3.2.3. Xét nghiệm định danh não mô cầu:
Nếu vi khuẩn phát triển trên các môi trường nuôi cấy (thạch máu 5% hoặc thạch sôcôla), nhặt khuẩn lạc nghi ngờ cấy thuần trên một đĩa thạch mới để nhuộm Gram xem hình thể và làm các thử nghiệm xác định sau đây:

Thử nghiệm oxidase:
Làm ướt thanh giấy lọc đã được sấy vô khuẩn từ trước bởi thuốc thử oxidase (tetramethyl-p-phenylenediamine hydrochloride), lấy que cấy nhựa (1µl) gặt 1 khuẩn lạc nghi ngờ và quệt lên thanh giấy đã tẩm thuốc thử oxidase, nếu vùng giấy được quệt vi khuẩn chuyển màu tím tía được đọc là dương tính (vi khuẩn có cytochrome oxidase - là một thành phần trong chuỗi hô hấp của vi khuẩn).

Thử nghiệm oxy hóa đường (Cystine Trypticase Agar (CTA):
Thử nghiệm phản ứng sinh hoá với 4 loại đ­­ường Glucose (hay Dextrose), Maltose, Lactose và Sucrose xác định đặc tính oxi hóa carbohydrate sinh axit của vi khuẩn (có đỏ phenol là chỉ thị màu) như sau:
- Cấy thuần vi khuẩn cần xác định là não mô cầu lên môi trường thạch máu cừu 5% hoặc thạch sôcôla 16-18 giờ.
- Lấy một vài khuẩn lạc cần xác định là não mô cầu lần lượt ria cấy sâu 10 mm vào các ống thạch CTA sau: CTA (không có đường), CTA + Glucose, CTA + Maltose, CTA + Lactose và CTA + Sucrose, mỗi lần cắm khuẩn lạc phải đổi ăng hoặc đốt ăng cấy.
- Đậy nắp những lọ hay ống nghiệm sinh hoá này, ủ ở tủ ấm 350C - 370C không có CO2.
Đọc kết quả sau 4-72 giờ. Sau 72 giờ nếu âm tính mới được hủy ống thử nghiệm.
Phản ứng dương tính (+) khi: phần trên của ống nghiệm sẽ thấy đục và chuyển màu vàng do não mô cầu sinh axit khi sử dụng đường glucose và maltose (theo kiểu ôxi hoá đường), nhưng không sử dụng đường lactose và sucrose.

Hình 4. Phản ứng sinh hóa Cystine Trypticase Agar (bộ CTA)

Xác định typ huyết thanh (nếu có điều kiện):
Tuỳ theo cấu trúc kháng nguyên vỏ hay protein màng ngoài, não mô cầu có 13 typ huyết thanh. Typ huyết thanh được xác định bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh đặc hiệu, chú ý các typ A,B,C,Y, W135 như sau:
- Cấy thuần vi khuẩn não mô cầu (trên thạch máu hoặc sôcôla) qua đêm hoặc từ 8 – 12 giờ.
- Tạo huyền dịch vi khuẩn có độ đục tương đương độ đục 1 đến 2 Mc Farland trong nước muối sinh lý có 0,05% formalin.
- Lau sạch phiến kính bằng cồn và chia 3 ô (cho 3 chủng vi khuẩn hoặc cho 3 typ kháng thể).
- Đặt 15µl huyền dịch vi khuẩn gần trung tâm mỗi ô.
- Đặt 15µl kháng huyết thanh đặc hiệu bên cạnh huyền dịch vi khuẩn (sử dụng từng typ huyết thanh hoặc A hoặc B hoặc C).
- Dùng que nhựa hoặc tăm gỗ trộn đều.
- Theo dõi hiện tượng ngưng kết trong vòng 1 đến 2 phút tuỳ theo hướng dẫn của Nhà sản xuất sinh phẩm (thường phản ứng ngưng kết giữa vi khuẩn và kháng thể đặc hiệu xảy ra trong vòng 1 phút).
- Cần có chứng âm : vi khuẩn trộn trong nước muối sinh lý 0,5% formalin (không có hiện tượng ngưng kết).

3.3. Sơ đồ tóm tắt quy trình xét nghiệm

3.4. Tiêu chuẩn xác định vi khuẩn não mô cầu
- Đặc điểm khuẩn lạc: tròn vồng nhẹ, xám nhạt (gần giống khuẩn lạc vi khuẩn H. influenzae có vỏ) nhưng không có mùi đặc biệt, không gây tan huyết môi trường nuôi cấy. Não mô cầu phát triển được trên cả thạch máu (cừu hay thỏ) 5% và thạch sôcôla.
- Hình thể vi khuẩn: ở dạng song cầu hình hạt đậu hay hạt cà phê xếp úp vào nhau, bắt màu Gram âm (Hình 1,2).
- Thử nghiệm Oxidase: cytochrome oxidase (+).
-Thử nghiệm phản ứng sinh hoá 4 loại đ­­ường (vi khuẩn sử dụng carbohydrate sinh axit, đỏ phenol là chỉ thị màu):
*Glucose (+), Maltose (+): màu vàng.
*Lactose (-), Sucrose (-): màu đỏ.

3.5. Chú ý:
Điều kiện nuôi cấy để phân lập não mô cầu:
*Nhiệt độ 35-370C/ 5% C02/ 50% độ ẩm. Sử dụng tủ ấm C02 hoặc tủ ấm thường và bình kín đốt nến. Đọc kết quả phân lập sau 16-24h.
Chú ý: Nếu có điều kiện để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu hoặc gen đặc hiệu của não mô cầu, ly tâm dịch não tủy 15.000 vòng x 10 phút, dịch nổi sau ly tâm xử lý ở nhiệt độ 1000C/3’ và thực hiện phản ứng ngưng kết phát hiện kháng nguyên não mô cầu các typ A,B,C, W135 và Y. Phần “cặn” cất ở -700C để xử lý tách chiết ADN của vi khuẩn thực hiện PCR (nếu nuôi cấy âm tính hoặc có thể thực hiện ngay PCR với phần ”cặn”cùng thời gian với nuôi cấy phân lập).

4. Báo cáo kết quả (phiếu trả lời kết quả):

5. Kiểm soát chất lượng:
Để kiểm soát chất lượng cần đảm bảo:
- Có chủng vi khuẩn chuẩn (để kiểm soát chất lượng các điều kiện phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm).
- Môi trường nuôi cấy phân lập và sinh phẩm xác định phải còn hạn và được giữ theo đúng những yêu cầu về điều kiện bảo quản của Nhà sản xuất.
- Môi trường nuôi cấy phân lập và sinh phẩm xác định phải được kiểm tra chất lượng ngay sau khi nhận về hoặc ngay sau khi pha chế (đối với môi trường nuôi cấy phân lập).
- Đảm bảo các điều kiện phát triển của vi khuẩn trong quá trình ủ (nhiệt độ, khí trường…).
- Bệnh phẩm được lấy và bảo quản đúng cách.
- Có sổ sách ghi chép quá trình làm xét nghiệm (nhật ky phòng xét nghiệm).

6. Các yêu cầu về an toàn:
Tuân thủ các yêu cầu về an toàn sinh học cho người thực hiện và môi trường làm việc:
- Nơi thực hiện xử lý mẫu phải được cách ly với khu vực bàn giấy văn phòng.
- Người thực hiện trong quá trình làm việc phải có quần áo, mũ, khẩu trang, găng tay y tế.
- Các dụng cụ (ăng cấy, pipet…) hoặc được đốt qua đèn cồn hoặc phải được ngâm trong dung dịch khử trùng ngay sau khi thực hiện hoặc bỏ ngay vào túi rác chuyên dụng.
- Lau dọn vệ sinh khử trùng khu vực xử lý mẫu bệnh phẩm bằng hóa chất thích hợp ngay sau khi kết thúc xét nghiệm.

7. Chất thải phát sinh và phương pháp xử lý (tóm tắt)
- Bệnh phẩm và/hoặc chất đựng bệnh phẩm, dụng cụ xét nghiệm dùng 1 lần: sau khi xét nghiệm xong phải được cho vào thùng khử trùng chuyên dụng để khử trùng trước khi thải bỏ.
- Môi trường nuôi cấy bệnh phẩm: sau khi đã có kết quả phân lập phải được tập trung vào các thùng đựng chuyên dụng để hấp sấy khử trùng.

8. Tài liệu tham khảo
1. Josephine A. Morello, William M. Janda, and Gary V. Doern. Neisseria and Branhamella. (1991) Manual of Clinical Microbiology Fifth Edition. 258-276.
2. Robert S. Baltimore and Harry A. Feldman. (1991) Meningococcal Infections. Bacterial Infection of Human Epidemiology and Control, second edition p. 425- 440.
3.WHO/CDS/CSR/EDC/99.7.(1999). Identification of N. meningitidis. Laboratory Manual for the Diagnosis of meningitis Caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae. page 19-22.

PGS. TS. Phan Lê Thanh Hương
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương