1, Xác định hoạt độ GOT, GPT huyết thanh
a, nguyên lý
Các enzyme GOT, GPT xúc tác các phản ứng trao đổi amin. Trong đó :
GOT ( glutamate oxaloacetate transamilase ) = AST (Aspartat transamilase)
GPT ( glutamate pyruvate transamilase) = ALT ( Alanin transamilase)
Nguyên lý phương pháp xác định hoạt độ GOT, GPT như sau:
Aspartat + α- Cetoglutarat oxaloacetate + glutamate ( GOT xt)
Oxaloacetat pyruvate + CO2
Alanin + α-cetoglutarat pyruvate + glutamate ( GPT xt)
Pyruvat được tạo thành từ hai pư trên sẽ kết hợp với 2,4 dinitrophenylhydrazin (2,4 DNPH) tạo thành 2,4 dinitrophenylhydrazon có màu đỏ nâu trong môi trường kiềm. Đậm độ màu tỷ lệ với nồng độ Pyruvat tức là tỷ lên với hoạt độ của GOT và GPT.
b, Thuốc thử và bệnh phẩm
Đệm photphat 0,1 M, pH = 7,4
Natripyruvat chuẩn 22mg %, pha trong đệm photphat
Cơ chất GOT
Cơ chất GPT
2,4 DNPH 20mg %
NaOH 0,4 N
Bệnh phẩm là huyết thanh hoặc huyết tương chống đông bằng heparin hoặc EDTA.
Vỡ hồng cầu ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.
c, Tiến hành
Cho vào ống nghiệm to :
Thuốc thử
Ống trắng
ml Ống thử GOT
ml Ống thử GPT
ml
Cơ chất GOT 0,5 0,5
Cơ chất GPT 0,5
Huyết thanh 0,1 0,1
Lắc đều, ử ở 37 độ C trong 1 giờ
2,4 DNPH 0,5 0,5 0,5
Huyết thanh 0,1
Lắc đều để yên 20 phút ở nhiệt độ phòng
NaOH 0,4 N 5 5 5
Lắc đều để yêm 20 phút
Đo mật độ quang ở bước song 530nm. Cóng 1cm, đối chiếu với nước cất. Sau khi trừ đi mật độ quang của ống trắng, kết quả tính theo biểu đồ mẫu hoặc theo hệ số.
Thường hệ số F= 400
d, Giá trị tham khảo
ở người bình thường : GOT=1,5 µmol/ml/h (= 25 U/l) GPT= 1,3µmol/ml/h(= 21,67 U/l)
e, Ý nghĩa lâm sàng:
Các transamilase rất phổ biến trong các tổ chức của cơ thể, đặc biệt là GOT và GPT. GOT có nhiều ở cơ hơn ở gan còn GPT lại có nhiều ở gan hơn ở cơ. Sự phân bố của GOT và GPT trong tế bào cũng khác nhau. GPT chỉ có ở bào tương còn tới 70% GOT có ở ty thể.
Trong các bệnh về gan: khi có tổn thương tế bào nhu mô gan, cả GPT và GOT đều tăng trong huyêt thanh. Nhưng tùy theo diện tổn thương và mức độ tổn thương mà GOT và GPT thay đổi khác nhau.
Trong trường hợp tổn thương gan nặng như viêm gan nhiễm đôc hay xơ gan, ung thư gan, không những tế bào bị tổn thương mà cả ty thể cũng bị tổn thương. Cho nên trong trường hợp này GOT tang nhiều hơn GPT.
Trong trường hợp viêm gan virut cấp, diện tổn thương rộng nhưng mức độ tổn thương không sâu ( chỉ tổn thương màng tế bào) cho nên GPT tang cao hơn GOT.
Vì vậy việc xác định hoạt độ GOT và GPT không những có ý nghĩa trong chẩn đoán mà còn có ý nghĩa theo dõi điều trị và tiên lượng bệnh gan.
Trong bệnh nhồi máu cơ tim, tế bào cơ tim bị phá hủy cũng giải phóng nhiều GOT ra huyết tương. Cho nên xác định hoạt độ GOT cũng có tác dụng góp phần chẩn đoán nhồi máu cơ tim. Tuy nhiên GOT chỉ tang sau cơn đau đầu tiên khoảng 6-12h và tang cao nhất khoảng 36-48h sau nhồi máu cơ tim.
2, Định lượng Bilirubin toàn phần và trực tiếp trong huyết thanh
a, nguyên lý
Bilirubin huyết thanh kết hợp vs thuốc thử Diazo tạo thành phức hợp azobilirubin có màu hồng. Để định lượng bilirubin toàn phần, dung Cafein để tách bilirubin gián tiếp ra khoit albumin.
b, Thuốc thử:
Thuốc thử Erhlich
Dd HCl 1,5%
Thuốc thử Diazo pha ngay trước khi dung
Dd CoSO4
Bệnh phẩm là huyết thanh hoặc huyết tương không vỡ hồng cầu, phải làm ngay tránh tiếp xúc với ánh sang mặt trời.
c, tiến hành:
Cho vào 4 ống nhỡ như sau:
Bilirubin toàn phần Bilirubin trực tiếp
ống trắng ống thử ống trắng ống thử
Huyết thanh 0,25ml 0,25ml 0,25ml 0,25ml
Nước cất 1,5ml 1,5ml 2,0ml 2,0ml
Thuốc thử Erhlich 0,5ml 0,5ml
Thuốc thử Diazo 0,25ml 0,25ml
HCl 1,5% 0,25ml 0,25ml
Lắc đều để yên 6-10 phút, đo màu ở bước song 546nm.
c, Tính kết quả
[ bilirubin] = F*mật độ quang
F= 300
d, ý nghĩa lâm sang
ở người bình thường bilirubin Tp< 17µmol/l, bilirubin tt < 5µmol/l
Định lượng Bilirubin huyết thanh để chẩn đoán nguyên nhân và mức độ các bệnh vàng da. Có thể phân biệt 3 loại vàng da sau:
Vàng da trước gan
+ vàng da sinh lý ở trẻ sơ sinh
+ vàng da do ký sinh trùng sốt rét
+ vàng da do các bệnh về máu
Do hồng cầu bị phá hủy nhiều, Bilirubin toàn phần tăng và tăng chủ yếu là bilirubin tự do, không có bilirunin niệu vì bilirubin tự do không tan trong nước nên không qua đc màng lọc cầu thận, urobilinogen nước tiểu tăng
Vàng da tại gan
Viêm gan virut cấp
Viêm gan mãn
Xơ gan, ung thư gan
Do tế bào gan bị phá hủy , bị phù nề hoặc tổ chức xơ hay u phát triển chèn ép vào vi quản mật làm bilirubin ứ lại tràn vào máu. Bili tp tang, cả Bili tự do và lien hợp đều tang. Trong nước tiểu có Bili lien hợp và urobilinogen tang.
Vàng da sau gan
Tắc ống mật chủ do sỏi, giun chiu ống mật, u đầu tụy chèm ép ống mật chủ…
Trong vàng da sau gan, bilirubin huyết thanh tang chủ yếu lag Bili lien hợp ( nếu chức năng gan vẫn bình thường) có Bili niệu và không có urobilinogen. Phân trắng vì không có sắc tố mật xuống ruột.
3, Phát hiện Bilirubin niệu
a, nguyên lý
Oxy hóa bilirubin thành biliverdin có màu xanh bằng thuốc thử Fouchet ( FeCl3 trong acid trichloacetic)
b, thuốc thử
Dd BaCl2 10%
Thuốc thử Fouchet
Dd (NH4)2SO4
c, tiến hành:
cho vào ống nghiệm to : nước tiểu mới lấy 5ml
BaCl2 10% 2ml
Lắc đều, cho them 4-5 giọt amonisulphat bão hòa. Lắc đều để yên 10p. lọc bằng giấy lọc, thấm khô tủa bằng giấy thấm.
Nhỏ lên tủa 1 giọt thuốc thử Fouchet
Kết quả : phản ứng dương tính nếu có 1 vòng xanh xung quanh giọt thuốc thử Fouchet sau vài phút.
d, ý ngĩa xét nghiệm:
nếu có bilirubin niệu là loại liên hợp vì loại này tan được trong nước. loại bilirubin gián tiếp không tan trong nước nên kết hợp vs albumin máu và không qua được màng lọc cầu thận.
bilirubin niệu dương tính gặp trong các trường hợp viêm gan và tắc mật.
4, Định lượng albumin huyết thanh
a.Nguyên lý
ở pH = 4,1 albumin có đặc trưng như là một cation thực thụ và có thể lien kết vs bromocresol green (BCG) tạo thành phức hợp có màu xanh đậm ( blue green)
đậm độ màu tỷ lệ vs nồng độ albumin và được đo bằng quang kế ở bước song 623nm or 578nm.
b.Thuốc thử
Thuốc thử 1 (R1) dung dịch đệm
Đệm citrate 95mmol/l, pH = 4,1
Thuốc thử 2 ( R2) : cơ chất
Đệm citrate 95 mmol/l, pH 4,1
Bromocresol green 0,66 mmol/l
Albumin chuẩn: 36,2 g/l or nồng độ khác tùy theo nơi sản xuất .
Trước khi là, trộn R1 vs R2 theo tỷ lệ R1:R2 = 5:1
c.Tiến hành
Cho vào các ống nghiệm nhỏ như sau :
ống trắng ống chuẩn ống thử
Hỗn hợp thuốc thử 1ml 1ml 1ml
Nước cất 10µl
Albumin chuẩn 10µl
Huyết thanh 10µl
Trộn đều để 5p ở nhiệt độ phòng. Đo mật độ quang đối chiếu với ống trắng.
d.Tính kết quả:
Albumin (g/l) = (OD thử)/(OD chuẩn )* n
OD thử : mật độ quang ống huyết thanh
OD chuẩn : mật độ quang ống albumin chuẩn
n: nồng độ albumin chuẩn = 36,2 g/l ( tùy nơi sản xuất)
e.ứng dụng lâm sang
trong thực tế hiếm gặp trường hợp nào albumin tang tuyệt đối trong máu, mà chỉ tăng tương đối trong trường hợp máu cô.
Định lượng albumin huyết thanh chủ yếu để chẩn đoán các bệnh làm giảm albumin. Gặp trong một số trường hợp sau:
Do màng lọc cầu thận bị tổn thương làm thoát albumin ra nước tiểu, gặp trong các trường hợp viêm thận cấp, mạn tính, thận hư nhiễm mỡ, nhiễm độc thai nghén.
Do suy chức năng gan, albumin được tổng hợp duy nhất ở gan cho nên khi suy chức năng gan, albumin huyết thanh giảm.
Do suy dinh dưỡng thiếu cơ chất là aminoacid để tổng hợp albumin
Do suy tim làm giảm tốc độ dòng máu qua thận, albumin có thể khuyếch tán qua màng lọc cầu thận ra nươc tiểu.
a, nguyên lý
Các enzyme GOT, GPT xúc tác các phản ứng trao đổi amin. Trong đó :
GOT ( glutamate oxaloacetate transamilase ) = AST (Aspartat transamilase)
GPT ( glutamate pyruvate transamilase) = ALT ( Alanin transamilase)
Nguyên lý phương pháp xác định hoạt độ GOT, GPT như sau:
Aspartat + α- Cetoglutarat oxaloacetate + glutamate ( GOT xt)
Oxaloacetat pyruvate + CO2
Alanin + α-cetoglutarat pyruvate + glutamate ( GPT xt)
Pyruvat được tạo thành từ hai pư trên sẽ kết hợp với 2,4 dinitrophenylhydrazin (2,4 DNPH) tạo thành 2,4 dinitrophenylhydrazon có màu đỏ nâu trong môi trường kiềm. Đậm độ màu tỷ lệ với nồng độ Pyruvat tức là tỷ lên với hoạt độ của GOT và GPT.
b, Thuốc thử và bệnh phẩm
Đệm photphat 0,1 M, pH = 7,4
Natripyruvat chuẩn 22mg %, pha trong đệm photphat
Cơ chất GOT
Cơ chất GPT
2,4 DNPH 20mg %
NaOH 0,4 N
Bệnh phẩm là huyết thanh hoặc huyết tương chống đông bằng heparin hoặc EDTA.
Vỡ hồng cầu ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.
c, Tiến hành
Cho vào ống nghiệm to :
Thuốc thử
Ống trắng
ml Ống thử GOT
ml Ống thử GPT
ml
Cơ chất GOT 0,5 0,5
Cơ chất GPT 0,5
Huyết thanh 0,1 0,1
Lắc đều, ử ở 37 độ C trong 1 giờ
2,4 DNPH 0,5 0,5 0,5
Huyết thanh 0,1
Lắc đều để yên 20 phút ở nhiệt độ phòng
NaOH 0,4 N 5 5 5
Lắc đều để yêm 20 phút
Đo mật độ quang ở bước song 530nm. Cóng 1cm, đối chiếu với nước cất. Sau khi trừ đi mật độ quang của ống trắng, kết quả tính theo biểu đồ mẫu hoặc theo hệ số.
Thường hệ số F= 400
d, Giá trị tham khảo
ở người bình thường : GOT=1,5 µmol/ml/h (= 25 U/l) GPT= 1,3µmol/ml/h(= 21,67 U/l)
e, Ý nghĩa lâm sàng:
Các transamilase rất phổ biến trong các tổ chức của cơ thể, đặc biệt là GOT và GPT. GOT có nhiều ở cơ hơn ở gan còn GPT lại có nhiều ở gan hơn ở cơ. Sự phân bố của GOT và GPT trong tế bào cũng khác nhau. GPT chỉ có ở bào tương còn tới 70% GOT có ở ty thể.
Trong các bệnh về gan: khi có tổn thương tế bào nhu mô gan, cả GPT và GOT đều tăng trong huyêt thanh. Nhưng tùy theo diện tổn thương và mức độ tổn thương mà GOT và GPT thay đổi khác nhau.
Trong trường hợp tổn thương gan nặng như viêm gan nhiễm đôc hay xơ gan, ung thư gan, không những tế bào bị tổn thương mà cả ty thể cũng bị tổn thương. Cho nên trong trường hợp này GOT tang nhiều hơn GPT.
Trong trường hợp viêm gan virut cấp, diện tổn thương rộng nhưng mức độ tổn thương không sâu ( chỉ tổn thương màng tế bào) cho nên GPT tang cao hơn GOT.
Vì vậy việc xác định hoạt độ GOT và GPT không những có ý nghĩa trong chẩn đoán mà còn có ý nghĩa theo dõi điều trị và tiên lượng bệnh gan.
Trong bệnh nhồi máu cơ tim, tế bào cơ tim bị phá hủy cũng giải phóng nhiều GOT ra huyết tương. Cho nên xác định hoạt độ GOT cũng có tác dụng góp phần chẩn đoán nhồi máu cơ tim. Tuy nhiên GOT chỉ tang sau cơn đau đầu tiên khoảng 6-12h và tang cao nhất khoảng 36-48h sau nhồi máu cơ tim.
2, Định lượng Bilirubin toàn phần và trực tiếp trong huyết thanh
a, nguyên lý
Bilirubin huyết thanh kết hợp vs thuốc thử Diazo tạo thành phức hợp azobilirubin có màu hồng. Để định lượng bilirubin toàn phần, dung Cafein để tách bilirubin gián tiếp ra khoit albumin.
b, Thuốc thử:
Thuốc thử Erhlich
Dd HCl 1,5%
Thuốc thử Diazo pha ngay trước khi dung
Dd CoSO4
Bệnh phẩm là huyết thanh hoặc huyết tương không vỡ hồng cầu, phải làm ngay tránh tiếp xúc với ánh sang mặt trời.
c, tiến hành:
Cho vào 4 ống nhỡ như sau:
Bilirubin toàn phần Bilirubin trực tiếp
ống trắng ống thử ống trắng ống thử
Huyết thanh 0,25ml 0,25ml 0,25ml 0,25ml
Nước cất 1,5ml 1,5ml 2,0ml 2,0ml
Thuốc thử Erhlich 0,5ml 0,5ml
Thuốc thử Diazo 0,25ml 0,25ml
HCl 1,5% 0,25ml 0,25ml
Lắc đều để yên 6-10 phút, đo màu ở bước song 546nm.
c, Tính kết quả
[ bilirubin] = F*mật độ quang
F= 300
d, ý nghĩa lâm sang
ở người bình thường bilirubin Tp< 17µmol/l, bilirubin tt < 5µmol/l
Định lượng Bilirubin huyết thanh để chẩn đoán nguyên nhân và mức độ các bệnh vàng da. Có thể phân biệt 3 loại vàng da sau:
Vàng da trước gan
+ vàng da sinh lý ở trẻ sơ sinh
+ vàng da do ký sinh trùng sốt rét
+ vàng da do các bệnh về máu
Do hồng cầu bị phá hủy nhiều, Bilirubin toàn phần tăng và tăng chủ yếu là bilirubin tự do, không có bilirunin niệu vì bilirubin tự do không tan trong nước nên không qua đc màng lọc cầu thận, urobilinogen nước tiểu tăng
Vàng da tại gan
Viêm gan virut cấp
Viêm gan mãn
Xơ gan, ung thư gan
Do tế bào gan bị phá hủy , bị phù nề hoặc tổ chức xơ hay u phát triển chèn ép vào vi quản mật làm bilirubin ứ lại tràn vào máu. Bili tp tang, cả Bili tự do và lien hợp đều tang. Trong nước tiểu có Bili lien hợp và urobilinogen tang.
Vàng da sau gan
Tắc ống mật chủ do sỏi, giun chiu ống mật, u đầu tụy chèm ép ống mật chủ…
Trong vàng da sau gan, bilirubin huyết thanh tang chủ yếu lag Bili lien hợp ( nếu chức năng gan vẫn bình thường) có Bili niệu và không có urobilinogen. Phân trắng vì không có sắc tố mật xuống ruột.
3, Phát hiện Bilirubin niệu
a, nguyên lý
Oxy hóa bilirubin thành biliverdin có màu xanh bằng thuốc thử Fouchet ( FeCl3 trong acid trichloacetic)
b, thuốc thử
Dd BaCl2 10%
Thuốc thử Fouchet
Dd (NH4)2SO4
c, tiến hành:
cho vào ống nghiệm to : nước tiểu mới lấy 5ml
BaCl2 10% 2ml
Lắc đều, cho them 4-5 giọt amonisulphat bão hòa. Lắc đều để yên 10p. lọc bằng giấy lọc, thấm khô tủa bằng giấy thấm.
Nhỏ lên tủa 1 giọt thuốc thử Fouchet
Kết quả : phản ứng dương tính nếu có 1 vòng xanh xung quanh giọt thuốc thử Fouchet sau vài phút.
d, ý ngĩa xét nghiệm:
nếu có bilirubin niệu là loại liên hợp vì loại này tan được trong nước. loại bilirubin gián tiếp không tan trong nước nên kết hợp vs albumin máu và không qua được màng lọc cầu thận.
bilirubin niệu dương tính gặp trong các trường hợp viêm gan và tắc mật.
4, Định lượng albumin huyết thanh
a.Nguyên lý
ở pH = 4,1 albumin có đặc trưng như là một cation thực thụ và có thể lien kết vs bromocresol green (BCG) tạo thành phức hợp có màu xanh đậm ( blue green)
đậm độ màu tỷ lệ vs nồng độ albumin và được đo bằng quang kế ở bước song 623nm or 578nm.
b.Thuốc thử
Thuốc thử 1 (R1) dung dịch đệm
Đệm citrate 95mmol/l, pH = 4,1
Thuốc thử 2 ( R2) : cơ chất
Đệm citrate 95 mmol/l, pH 4,1
Bromocresol green 0,66 mmol/l
Albumin chuẩn: 36,2 g/l or nồng độ khác tùy theo nơi sản xuất .
Trước khi là, trộn R1 vs R2 theo tỷ lệ R1:R2 = 5:1
c.Tiến hành
Cho vào các ống nghiệm nhỏ như sau :
ống trắng ống chuẩn ống thử
Hỗn hợp thuốc thử 1ml 1ml 1ml
Nước cất 10µl
Albumin chuẩn 10µl
Huyết thanh 10µl
Trộn đều để 5p ở nhiệt độ phòng. Đo mật độ quang đối chiếu với ống trắng.
d.Tính kết quả:
Albumin (g/l) = (OD thử)/(OD chuẩn )* n
OD thử : mật độ quang ống huyết thanh
OD chuẩn : mật độ quang ống albumin chuẩn
n: nồng độ albumin chuẩn = 36,2 g/l ( tùy nơi sản xuất)
e.ứng dụng lâm sang
trong thực tế hiếm gặp trường hợp nào albumin tang tuyệt đối trong máu, mà chỉ tăng tương đối trong trường hợp máu cô.
Định lượng albumin huyết thanh chủ yếu để chẩn đoán các bệnh làm giảm albumin. Gặp trong một số trường hợp sau:
Do màng lọc cầu thận bị tổn thương làm thoát albumin ra nước tiểu, gặp trong các trường hợp viêm thận cấp, mạn tính, thận hư nhiễm mỡ, nhiễm độc thai nghén.
Do suy chức năng gan, albumin được tổng hợp duy nhất ở gan cho nên khi suy chức năng gan, albumin huyết thanh giảm.
Do suy dinh dưỡng thiếu cơ chất là aminoacid để tổng hợp albumin
Do suy tim làm giảm tốc độ dòng máu qua thận, albumin có thể khuyếch tán qua màng lọc cầu thận ra nươc tiểu.
ChuốiCảNải
