Alcaloid độc của Lá ngón( koumin, kouninidin, kouminin, kouminixin) và Mã tiền( Strichnin, Brucin) trong các mẫu thử được chiết tách từ cắn B qua các phản ứng màu, sắc ký lớp mỏng, đo quang phổ UV, phản ứng sinh vật để xác định.

2. Quy trình kỹ thuật:

2.1 Chuẩn bị:

- Dụng cụ: Bát sứ, đũa thuỷ tinh, Bản mỏng Silicagel G hoặc 60GF254, Bình triển khai sắc ký, đầu côn nhỏ, đầu phun sương, quả bóp, máy sấy, máy đo UV, bơm tiêm 1mL.

- Hoá chất: Acid sulfuric đặc, tinh thể Kali bicromat, Toluen, Aceton, Ethanol, Amoniac, H[sub]2[/sub]SO[sub]4[/sub] 10%, Dragendoff…

- Động vật: Chuột nhắt trắng

- Mẫu thử: Mẫu thử được chiết theo quy trình chung bằng Cloroform.

2.2.1 Phản ứng màu:

- Cho vào bát sứ 2-3 giọt cặn chiết B, sấy khô. Thêm vào 1 giọt acid sulfuric đặc và 1 hạt tinh thể kalibicromat. Dùng đũa thuỷ tinh di nhẹ tinh thể Kali bicromat qua vùng có Acid Sulfuric. Xuất hiện màu tím( chú ý quan sát ngay)

- Cho vào bát sứ 2-3 giọt cặn chiết B, sấy khô. Thêm vào 2-3 giọt acid Nitric đặc, xuất hiện màu đỏ thẫm ( Brucin) chuyển dần sang da cam rồi vàng.

- Pha dung môi khai triển Toluen- Aceton- Ethanol- Amoniac với tỉ lệ tương đương 45:45:7:3 lắc đều rồi đổ vào bình triển khai( chú ý đổ 1 lượng không quá 1cm chiều cao trong bình triển khai) đậy nắp lại để dung môi hoà trộn đều trước khi đặt bản sắc ký vào ít nhất 15 phút.

- Dùng đầu côn nhỏ chấm khoảng 15µL mẫu thử lên bản mỏng. Đồng thời chấm mẫu chuẩn đối chiếu cách mẫu thử khoảng 1cm. Chú ý chấm cách mép dưới bản mỏng khoảng 1cm và vết chấm càng gọn càng tốt, vừa chấm ta vừa sấy khô.

- Đặt bản mỏng vào trong bình triển khai đã có sẵn dung môi ở trên. Chờ dung môi ngấm dần lên tới khi cách mép trên 1cm ta nhấc bản mỏng ra. Có thể để khô tự nhiên hoặc sấy khô.

- Soi qua đèn tử ngoại để nhận biết sơ bộ.

- Phun thuốc thủ hiện màu là Dragendoff bằng đầu phun hơi sương. Sau đó tăng độ nhậy bằng acid sulfuric 10%.. Để khô tự nhiên hoặc sấy khô.

Kết quả: Mẫu thử là Lá ngón cho 4 vết màu vàng trên bản mỏng và có Rf tương đương với mẫu chuẩn. Mẫu thử là mã tiền có 2 vết màu vàng cam trên bản mỏng và có Rf tương đương với mẫu chuẩn.

- Cách 1: Lấy cặn chiết B đem hoà tan vào Ethanol( có thể lọc qua giấy lọc) đo quang phổ UV- VIS.

Kết quả: + Mã tiền cho 2 đỉnh phổ cực đại tại 256nm và 264nm

+ Lá ngón cho 4 đỉnh phổ cực đại.

- Cách 2: Chạy sắc ký bản mỏng của cặn chiết B sau đó sấy khô, soi đèn tử ngoại dùng bút chì xác định các vết. Cạo các vết này ra hoà tan vào Ethanol lọc qua giấy lọc sau đó đo quang phổ UV-VIS. Các đỉnh hấp thụ sẽ tương ứng cho từng Alcaloid.

2.2.4 Thử phản ứng trên sinh vật.

Cặn chiết B được hoà tan vào 0,5-1mL nước cất sau đó điều chỉnh về pH trung tính bằng acid sulfuric 10%.

Tiêm 0,5 mL vào dưới da cho chuột nhắt trắng. Chuột chết với các triệu chứng ngộ độc như sau:

- Ngộ độc lá ngón: Co giật, mắt lồi, chân duỗi thẳng.

- Ngộ độc mã tiền: Sợ tiếng động, co giật tăng dần, co cứng, chết do ngạt thở.

Mẫu thử phải dương tính với các phương pháp trên mới có thể kết luận. Ngoài ra hiện nay để kết quả đạt độ chính xác cao và xác định được hàm lượng ta dùng kỹ thuật phân tích trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao có gắn khối phổ( HPLC-MS)