Diễn đàn xét nghiệm đa khoa
Qui trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Streptococcus pneumoniae - Phiên bản có thể in

+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Vi sinh Y học (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-71.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-98.html)
+---- Chủ đề: Qui trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Streptococcus pneumoniae (/thread-73.html)

Qui trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Streptococcus pneumoniae - tuyenlab - 01-12-2012

QUI TRÌNH NUÔI CẤY PHÂN LẬP VI KHUẨN Streptococcus pneumoniae
1. Phạm vi áp dụng: phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng từ cấp tỉnh, thành phố, trung ương.
2. Giải thích từ ngữ:
Thuật ngữ Diplococcus pneumoniae được sử dụng năm 1926 do các đặc tính của vi khuẩn xuất hiện khi nhuộm Gram mẫu bệnh phẩm đờm của bệnh nhân (cầu khuẩn nối đôi). Năm 1928, những nghiên cứu trên vi khuẩn Pneumococcus gây bệnh viêm phổi ở chuột đã giúp các nhà sinh học đi đến kết luận vật liệu chứa thông tin di truyền là ADN. Sau đó vào năm 1974, qua nuôi cấy phân lập trên môi trường nhân tạo, các nhà khoa học đã phát hiện vi khuẩn này mọc thành chuỗi trong môi trường lỏng và đổi tên thành Streptococcus pneumoniae (liên cầu gây viêm phổi hay phế cầu).

3. Nguyên lý (đặc điểm):
Phế cầu (Streptococcus pneumoniae) là thành viên phổ biến của hệ vi khuẩn chí vùng hầu họng, nhưng cũng là một tác nhân chủ yếu của viêm phổi và viêm màng não ở trẻ em và người lớn.
S. pneumoniae còn được gọi là Diplococcus pneumoniae hoặc pneumococcus (phế cầu khuẩn) là một tác nhân gây bệnh ở người được phân lập đầu tiên ở Pháp bởi LouisPasteur năm 1880 từ mủ apxe. Năm 1883, Talamon (Pháp) phát hiện được phế cầu khuẩn trong đờm, trong máu và trong khối viêm phổi gan hóa của bệnh nhân và mô tả nó. Vai trò của phế cầu gây viêm màng não cấp đã được Netter phát hiện vào năm 1909 khi quan sát thấy hội chứng nhiễm trùng thần kinh trung ương ở một số người bệnh có triệu chứng viêm phổi nặng.
Các chủng phế cầu khác nhau có thể được phân biệt nhờ vào cấu trúc kháng nguyên của lớp vỏ polysaccarit bao bọc bên ngoài tế bào. Lớp vỏ polysaccarit tạo nên 1 trong những đặc tính của vi khuẩn khi phát triển trên môi trường nuôi cấy nhân tạo:
+ Pneumococci dạng S (smooth) có bề mặt khuẩn lạc nhẵn, tròn, kích thước 1mm, mặt bóng hơi lõm được tạo nên bởi những vi khuẩn có vỏ và có khả năng gây bệnh.
+ Pneumococci dạng R (rough) là những phế cầu bị mất vỏ polysaccarit (có thể do điều kiện nuôi cấy không đủ chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoặc nuôi cấy trong một thời gian dài), tạo nên những khuẩn lạc có bề mặt sần, bờ không đều, mặt gồ ghề, khô...những phế cầu này ít có khả năng gây bệnh.
Dạng S có thể biến thành dạng R, mất vỏ và mất khả năng gây bệnh. Ngược lại dạng R có thể biến thành dạng S khi cho vào môi trường nuôi cấy chất ADN của dạng S.
Trên môi trường thạch máu 5% (cừu, thỏ), khuẩn lạc tròn bóng ướt do vi khuẩn có vỏ, không sắc tố, có khuynh hướng lõm ở giữa vì sự hoạt động của enzym ly giải.

4. Phương pháp xét nghiệm xác định:
4.1. Lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển
Loại mẫu bệnh phẩm:
- Bệnh phẩm đường hô hấp bao gồm:
+ Đờm
+ Dịch hút phế quản
+ Dịch hút tỵ hầu
+ Tăm bông ngoáy họng
+ Tăm bông ngoáy tỵ hầu
- Máu
- Dịch não tủy

Thiết bị, dụng cụ lấy mẫu:
- Lọ, ống nghiệm sạch có nắp xoáy ngoài đựng bệnh phẩm
- Tăm bông ngoáy họng và tăm bông ngoáy tỵ hầu chuyên dụng
- Máy hút chân không áp lực thấp + ống xông nhỏ (catheter)
- Dụng cụ đè lưỡi dùng 01 lần
- Que cấy dung tích 1µl và 10µl
- Các loại ống nghiệm thủy tinh 15 – 20ml
- Ống nghiệm nhựa (cryotube và eppendorf để bảo quản mẫu và ly tâm)
- Giá để ống nghiệm
- Ống hút nhựa 1ml (có quả bóp) dùng một lần
- Pipet chính xác và các loại đầu tip
- Máy Vortex (máy trộn)
- Đĩa petri nhựa vô trùng d=90mm
- Kính hiển vi ánh sáng thường
- Máy ly tâm thường (4000 vòng hoặc ≤ 15.000 vòng)
- Tủ ấm CO2 hoặc tủ ấm 37[sup]0[/sup]C + bình kín (để đốt được nến).
Môi trường nuôi cấy, hóa chất, thuốc thử:
- Nước muối sinh lý 0,9%.
- Môi trường canh thang TSI (Trypticase soy infusion), BHI (Brain-Heart Infusion) của Merck hoặc tương đương.
- Môi trường thạch dinh dưỡng TSA ‘Trypticase soy agar’ (của Merck hoặc tương đương).
- Môi trường thạch máu cừu 5%: tự pha chế hoặc đã pha sẵn của Becton Dickinson hoặc tương đương.
- Dung dịch bổ sung dinh dưỡng Fildes Enrichment (BD BBL Co.,) hoặc máu động vật chống đông (cừu, thỏ).
- Khoanh giấy P – Pneumococci Ethylhydrocupreine hydrochloride 5µg (Optochin - BD BBL “P” ; REF: 231047) của Becton, Dickinson hoặc tương đương.
- Bột muối mật (deoxycholate).
- Dung dịch Acetein (N-acetyl- L- cystine) để xử l‎ý bệnh phẩm nhày và đờm.
Lấy mẫu:
Bệnh phẩm đường hô hấp:
+ Đờm: đờm được lấy vào buổi sáng sớm, vỗ lưng, ho và khạc sâu, đờm được giữ ở hộp vô khuẩn rồi chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 2 giờ hoặc phải giữ ở nhiệt độ 4[sup]0[/sup]C-8[sup]0[/sup]C và không lâu quá 24 giờ.
+ Dịch phế quản: lấy qua ống xông.
+ Dịch tỵ hầu (mũi-họng): lấy qua ống xông nhỏ bằng nhựa mềm (ống catheter) và hút bằng máy hút chân không áp lực nhẹ: dùng ống nhựa nhỏ mềm đưa sâu qua lỗ mũi một khoảng cách bằng khoảng cách từ đỉnh mũi đến ống tai ngoài của bệnh nhân để hút dịch.
+ Tăm bông ngoáy tỵ hầu: thường áp dụng với trẻ nhỏ < 5 tuổi, dùng tăm bông cán thép mảnh mềm (hoặc tăm bông nhựa chuyên dụng của Becton Dickinson) lấy chất dịch ở ngã ba mũi - họng theo đường mũi: đưa tăm bông vào sâu bằng một nửa khoảng cách tính từ cánh mũi đến dái tai cùng phía, vê nhẹ rồi rút ra. Chú ý, nếu chưa vào đủ độ sâu đã có vật cản không được cố lấy mà phải làm lại ở mũi bên kia. Tăm bông phải đảm bảo không dễ bị tụt đầu bông vào khí quản và cán làm bằng kim loại hay nhựa mềm không gỉ và không dễ gẫy khi thực hiện thao tác.
+ Tăm bông ngoáy họng: đè lưỡi, dùng tăm bông vô khuẩn đã được làm ẩm bằng nước muối sinh lý (vô khuẩn) chà sát một trong những vị trí sau đây: 2 hốc amidan, thành sau họng (sau lưỡi gà). Tránh không được chạm vào lưỡi, răng, mặt trong má và lưỡi gà. Sau đó phải cắm tăm bông vào môi trường vận chuyển (T-I) nếu chưa cấy ngay hoặc nếu phải vận chuyển.
Dịch não tuỷ:
Lấy dịch não tuỷ trong trường hợp nghi viêm màng não, dùng kim chọc tủy sống vô khuẩn lấy từ 1- 3ml dịch não tủy, đựng trong ống nghiệm đã tiệt trùng. Sau đó, hoặc chuyển ngay về phòng thí nghiệm, hoặc cho vào môi trường bảo quản T-I nếu thời gian vận chuyển kéo dài. Không được để bệnh phẩm chịu tác động trực tiếp của ánh sáng mặt trời hoặc không để quá lạnh hay quá nóng (lưu ý: bác sĩ lâm sàng sẽ thực hiện kỹ thuật này).
Máu:
Lấy máu trong trường hợp bệnh nhân có sốt cao, nghi nhiễm khuẩn huyết hoặc nghi viêm màng não, viêm phổi cấp, dùng bơm kim tiêm vô khuẩn lấy ít nhất 3ml máu tĩnh mạch (trẻ nhỏ), 5ml đến 10ml (người lớn) cho ngay vào bình canh thang não-tim (Brain-Heart Infusion) hay Trypticasein soy có bổ xung 5% Fildes enrichment (BD BBL) hay 5% máu động vật hoặc glucose 2%; 0,025% SPS (sodium polyanetholesulfonate – một chất chống tạo màng máu, chống các chất diệt vi khuẩn) và có thể thêm chất resins (có tác dụng hấp phụ các chất diệt khuẩn hay kháng sinh có trong máu bệnh nhân). Cấy theo tỷ lệ 1 phần máu 10 phần canh thang, hoặc sử dụng chai cấy máu do các Hãng thương mại pha chế sẵn (BACTEC Plus).
Việc pha loãng máu trong canh thang nuôi cấy theo tỷ lệ 1/10 có tác dụng làm giảm các chất ức chế vi khuẩn hoặc kháng sinh có trong máu bệnh nhân.
Chú ý: động tác và quá trình lấy máu, cấy máu phải đảm bảo thật vô khuẩn trong một quy trình kín. Tốt nhất, kim lấy máu được nối trực tiếp vào bình môi trường qua một ống cao su hay plastic vô khuẩn. Sát trùng vị trí lấy máu bằng cồn iốt.
Các bệnh phẩm khác: mủ amiđan, mủ tai giữa, dịch chọc phổi, được chọc hút và đựng trong các ống nghiệm vô khuẩn.
Bảo quản và vận chuyển mẫu:
Phế cầu cũng là một vi khuẩn nhạy cảm và dễ chết ở ngoại cảnh, vì vậy tốt nhất các bệnh phẩm nên được chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 1 giờ, hoặc không quá 6 giờ (nhiệt độ phòng) và có thể giữ ở nhiệt độ 4-8[sup]0[/sup] C nhưng không quá 24h (trong môi trường vận chuyển).
Bệnh phẩm được lấy bằng tăm bông, nếu có điều kiện nuôi cấy ngay sau đó, bệnh phẩm chỉ cần giữ trong nước muối sinh lý. Nếu không có điều kiện cấy ngay, bệnh phẩm phải được giữ trong môi trường bảo quản T-I.
Bệnh phẩm là dịch não tủy, nếu không cấy ngay, nên giữ trong môi trường bảo quản T-I. Không ủ dịch não tủy trong tủ ấm (sẽ không quan sát được sự hội tụ bạch cầu đa nhân và vi khuẩn mau chết).
Tùy theo thời gian vận chuyển bệnh phẩm về phòng thí nghiệm hay thời gian bệnh phẩm chờ được xét nghiệm mà quyết định nhiệt độ lưu giữ bệnh phẩm. Trong vòng vài giờ có thể giữ ở nhiệt độ phòng (28-30[sup]0[/sup]C), nếu không thể cấy ngay, bệnh phẩm nên được giữ ở 4[sup]0[/sup]C - 8[sup]0[/sup]C.
Nếu quá trình luân chuyển từ 2- 4 giờ, bệnh phẩm có thể được cấy ngay lên môi trường hoặc tăng sinh trước trong canh thang (Tryptocasein soy hoặc hỗn hợp não tim – BHI có 5% máu) 2 giờ ở 37[sup]0[/sup]C, nếu thời gian chuyển bệnh phẩm từ 4-8 giờ bệnh phẩm nên được ủ trong canh thang ít nhất là 2 giờ rồi mới cấy ra thạch máu 5%.
Chủng vi khuẩn phế cầu được thu thập từ môi trường thạch máu 5% sau 14-18 giờ nuôi cấy ở 37[sup]0[/sup]C, được giữ trong môi trường canh thang TSI hoặc BHI có bổ xung 5% máu hoặc sản phẩm của máu động vật (Fildes enrichment hay Levinthal Base) và 20% glycerin ở - 70[sup]0[/sup]C (có thể tồn tại 1-2 năm), hoặc tồn tại nhiều năm nếu trong điều kiện đông khô. Giữ trong thời gian ngắn (vài ba ngày), phế cầu được nuôi cấy trên môi trường thạch máu 5% hay thạch nghiêng sôcôla và cất ở 4[sup] 0[/sup]C .

4.2. Phương pháp nuôi cấy, định danh xác định S. pneumoniae
4.2.1. Nuôi cấy phân lập:
+ Bệnh phẩm đường hô hấp:
Làm lỏng bệnh phẩm đường hô hấp (đờm, dịch nhày) bằng dung dịch Acetein (N-acetyl-L-cysteine) ở tỷ lệ đờm/dung dịch = 5/1. Dùng máy khuấy vortex làm tan đờm.
Pha loãng tiếp bệnh phẩm ít nhất 10 lần trong nước muối sinh lý và ria cấy 3 vùng cắt ngang (có đốt ăng cấy sau mỗi vùng).
dụng phương pháp cấy đếm đối với các mẫu bệnh phẩm đường hô hấp để phát hiện và phân biệt các vi khuẩn gây bệnh nói chung và S. pneumoniae nói riêng với các thành phần vi khuẩn chí ở đường hô hấp: với S. pneumoniae sau khi pha loãng bậc 10 với nước muối sinh lý (5 đến 6 ống), tiến hành cấy chia vùng (cấy đếm) trên môi trường thạch máu cừu 5% hoặc trên môi trường thạch máu thỏ tươi 7% (vì môi trường này có thể phân lập được nhiều loại vi khuẩn kể cả H. influenzae). Khẳng định tác nhân gây bệnh là S. pneumoniae dựa trên số lượng cấy đếm (số vi khuẩn có trong 01ml bệnh phẩm sẽ tăng lên rất đáng kể khi nó là tác nhân gây nhiễm trùng so với số lượng vi khuẩn khi sống cộng sinh).
+ Dịch não tủy (DNT): cấy 0,05ml DNT vào thạch máu 5% (Tryptocasein soy hoặc thạch não tim – BHI có bổ xung 5% máu đã lấy hết sợi tơ huyết) và 0,1ml vào canh thang tăng sinh (bổ sung 5% máu thỏ hay cừu hoặc có thể sử dụng canh thang tăng sinh có 5% Fildes enrichment), ủ các đĩa môi trường ở 37[sup]0[/sup]C/5% C02/16-24h. Trong trường hợp đĩa thạch máu cấy trực tiếp bệnh phẩm âm tính, phải cấy chuyển từ canh thang tăng sinh ra đĩa thạch máu mới ở các ngày thứ 2, 3 và 7.
+ Máu: trong trường hợp có sốt hoặc nghi nhiễm khuẩn huyết, cấy máu theo một chu trình kín vô khuẩn. Tuỳ theo bệnh nhân là trẻ nhỏ hay người lớn, lấy từ 3-10ml máu tĩnh mạch cấy vào bình canh thang não-tim (brain-heart infusion) hoặc trypticase soy có bổ xung máu động vật 5%, chất chống hình thành áo máu 0,025% SPS (sodium polyanethole sulfonate) và có thể thêm chất resins (có tác dụng hấp phụ các chất diệt khuẩn hay kháng sinh có trong máu bệnh nhân) theo tỷ lệ 1 phần máu 10 phần canh thang, sau đó ủ ở 37[sup]0[/sup]C/5% C02/16-24 giờ, nếu dương tính (canh thang đục, tan huyết, có váng...) cấy chuyển sang các môi trường thạch (thạch máu động vật 5%, hoặc 7%).
Các môi trường nuôi cấy phân lập phế cầu được ủ ấm trong khí trường 37[sup]0[/sup]C/5% C0[sub]2[/sub] từ 16 - 24 giờ. Nếu không có tủ ấm CO2, đặt các hộp lồng vào chuông thủy tinh kín và đốt 1 ngọn nến, khi nến tắt cũng tạo được khí trường có CO2, sau đó đặt chuông vào tủ ấm 37[sup]0[/sup] C, tuy nhiên phế cầu cũng có thể phát triển trong điều kiện không có hay có ít CO[sub]2[/sub].
Sau 16-24 giờ, quan sát trên môi trường thạch máu thấy các khuẩn lạc của phế cầu khuẩn có vỏ: tròn, dẹt, nhỏ (0,5-1,5mm), không màu, có xu hướng lõm giữa, xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết màu xanh (kiểu tan huyết alpha). Nếu quan sát khuẩn lạc ở thời gian sớm hơn (≤ 14h) có thể thấy khuẩn lạc chưa bị lõm giữa mà lại có đỉnh (là đặc điểm để phân biệt giữa phế cầu có vỏ và không có vỏ). Lấy một khuẩn lạc cấy thuần lại trên một đĩa thạch máu khác, ủ 37[sup]0[/sup]C/5% CO2/16 giờ, ngày tiếp theo làm thêm các thử nghiệm sau để khẳng định (nếu chỉ thấy thuần một loại khuẩn lạc thì không cần cấy thuần mà có thể làm luôn các bước khẳng định).

[Image: tanmau.jpg]
Hình 1. Kiểu tan máu alpha (α) trên môi trường thạch máu 5% của S. pneumoniae

4.2.2. Các xét nghiệm định danh vi khuẩn:
(1). Nhuộm Gram khuẩn lạc nghi ngờ là phế cầu:
Phế cầu bắt màu Gram dương nhưng tính chất này có thể bị mất do môi trường không đủ chất dinh dưỡng hoặc bệnh nhân đã dùng nhiều kháng sinh.

a/ Chuẩn bị thuốc nhuộm:
+ Thuốc nhuộm tím gentian:
Tím gentian, dung dịch bão hòa trong cồn 95[sup]o[/sup]: 10 ml
Axit phenic 1 ml
Nước cất 100 ml
Lắc đều lọc qua giấy.
+ Dung dịch lugol:
Iod 1 g
Kali Iodua 2 g
Nước 5 ml
Nghiền tan trong cối, rồi thêm nước cho đủ 200 ml
+ Thuốc nhuộm Fucsin kiềm:
Fucsin kiềm, dung dịch bão hòa trong cồn 95[sup]o[/sup]C: 10 ml
Axit phenic: 5 ml
Nước cất 100 ml
Lắc đều, lọc qua giấy.

b/ Cách nhuộm:
Dàn tiêu bản, để khô tự nhiên. Cố định tiêu bản trên phiến kính bằng cách hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn, kiểm tra độ nóng (nhẹ vừa phải trên mu bàn tay). Chú ý: nóng quá, hoặc hơ lâu, vi khuẩn sẽ biến dạng.
Đổ thuốc nhuộm tím gentian lên tiêu bản, để 1 phút, rửa nước.
Đổ dung dịch lugol lên tiêu bản, để 1 phút, hất bỏ đi.
Tẩy màu bằng cồn 90[sup]o[/sup] hoặc hỗn hợp Acetone + cồn 90[sup]0[/sup] (tỷ lệ 1:1) tới khi bạc màu.
Rửa qua nước.
Đổ thuốc nhuộm Fucsin lên tiêu bản, để 1 phút.
Rửa qua nước.
Thấm giấy lọc hoặc để khô ở không khí.

c/ Đọc kết quả:
Vi khuẩn Gram dương: màu tím (tím gentian).
Vi khuẩn Gram âm: màu đỏ (đỏ Fucsin).
Các vi khuẩn thuộc loại Gram dương có chất protein kiểu ‘magic ribonucleat’. Chất này khi gặp những thuốc màu thuộc loại pararosanilin (như tím gentian) và chất iod (lugol) kết lại thành một hợp chất không bị phá hủy bởi cồn. Do đó, khi dùng cồn để tẩy màu, những vi khuẩn Gram dương không bị ảnh hưởng.
Phế cầu: hình lưỡi mác, nối đôi, bắt màu Gram dương: xanh tím.

[Image: vikhuanSP.jpg]
Hình 2: vi khuẩn S. pneumoniae trong dịch não tủy
[u](2). Xác định tính nhạy cảm với Optochin [/u]: Cấy dày lên một đĩa thạch máu 5% vi khuẩn nghi ngờ là phế cầu, sau đó đặt khoanh giấy optochin d = 6mm (chứa 5µg chất ethylhydrocupreine) lên vùng đã cấy vi khuẩn, ủ 35-37[sup]O[/sup]C/5% CO[sub]2[/sub]. Quan sát sau 16-24 giờ nếu xung quanh khoanh giấy không có vòng vô khuẩn có nghĩa đó chỉ là viridans streptococci, nếu có vòng vô khuẩn với đường kính ≥ 14mm là dương tính (vi khuẩn được thử là phế cầu), nếu vòng vô khuẩn từ 9-13mm phải làm thêm thử nghiệm tan trong muối mật.

[Image: thunghiemoptochin.jpg]
Hình 3. Thử nghiệm optochin để xác định S. pneumoniae
(3). Xét nghiệm tính tan trong muối mật (Bile solubility): Xét nghiệm này chỉ làm khi thử nghiệm Optochin cho kết quả không rõ ràng i/ Từ chủng vi khuẩn được nuôi cấy thuần và mới (16-24 giờ), tạo 0,5 ml canh khuẩn trong nước muối sinh lý tương đương độ đục > 0,5 Mc Farland. ii/ Chia đôi canh khuẩn vào 2 ống nghiệm (0,25ml/1 ống), sau đó cho tiếp vào 1 ống canh khuẩn 0,25ml NaCl 0,9%, ống kia cho 0,25ml muối mật 2 - 10% (deoxycholate), lắc nhẹ, ủ 35-37[sup]0[/sup]C/ 2 giờ. iii/ Theo dõi sự ly giải tế bào vi khuẩn trong ống có muối mật sau 2 – 4 giờ ủ, nếu ống có muối mật trở nên trong, hết đục là dương tính. Nếu thực hiện trực tiếp thử nghiệm tan trong muối mật với khuẩn lạc nghi ngờ ở trên thạch máu, phải sử dụng dung dịch sodium deoxycholate 10%, đọc kết quả sau 15-20 phút nếu là phế cầu khuẩn, khuẩn lạc sẽ biến mất hoặc dẹt hẳn xuống do bị ly giải, trong khi khuẩn lạc khác thuộc nhóm liên cầu nhưng không phải phế cầu không bị tan trong dung dịch muối mật.

[Image: tantrongmuoi.jpg]
Hình 4. Thử nghiệm tan trong muối mật của S. pneumoniae
4.3. Sơ đồ tóm tắt quy trình xét nghiệm
[Image: sodophanlap-bai3.jpg]

4.4. Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định vi khuẩn Streptococcus pneumoniae
+ Hình thể khuẩn lạc trên môi trường thạch máu 5% (có hay không có gentamycin): tròn, nhỏ, dẹt, không màu, và có xu hướng lõm ở giữa (nhưng có ‘đỉnh’ khi quan sát sớm hơn 14 giờ nuôi cấy), môi trường nuôi cấy xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết alpha (màu xanh ve).
+ Hình thể vi khuẩn: hình lưỡi mác hay ngọn nến, nối đôi giống hình cặp kính, cũng có thể đứng đơn hay tạo chuỗi ngắn, bắt màu Gram dương (xanh tím) nhưng phải.
+ Nhạy cảm optochin: đường kính vòng vô khuẩn ≥ 14mm.
*Hoặc: ít nhạy cảm với optochin (đường kính vòng vô khuẩn từ 9-13mm) nhưng tan trong muối mật, cũng kết luận là phế cầu khuẩn.

Không phải là phế cầu khuẩn khi:
+ Không nhạy cảm với optochin.
*Hoặc có vùng ức chế phát triển bởi optochin với đường kính < 14 mm nhưng không tan trong muối mật.
*Phản ứng catalase có thể là một biện pháp phân biệt phế cầu với liên cầu nói chung (catalase âm tính ở phế cầu).


4.5. Chú ý:

Vi khuẩn S. pneumoniae sẽ không phát triển khi:

+ Môi trường thạch máu không đảm bảo chất lượng (máu loãng ít hồng cầu, để lâu, đổ mỏng).

+ Bảo quản bệnh phẩm không đúng cách. Bệnh phẩm để lâu mới xử l‎ý.


5. Báo cáo kết quả (phiếu trả lời kết quả)
[Image: phieutraloiKQ.jpg]

6. Kiểm soát chất lượng:
Để kiểm soát chất lượng cần đảm bảo:
- Có chủng vi khuẩn chuẩn (để kiểm soát chất lượng các điều kiện phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm).
- Môi trường nuôi cấy phân lập và sinh phẩm xác định phải còn hạn và được giữ theo đúng những yêu cầu về điều kiện bảo quản của Nhà sản xuất.
- Môi trường nuôi cấy phân lập và sinh phẩm xác định phải được kiểm tra chất lượng ngay sau khi nhận về hoặc ngay sau khi pha chế (đối với môi trường nuôi cấy phân lập).
- Đảm bảo các điều kiện phát triển của vi khuẩn trong quá trình ủ (nhiệt độ, khí trường…).
- Bệnh phẩm được lấy và bảo quản đúng cách.
- Có sổ sách ghi chép quá trình làm xét nghiệm (nhật ký phòng xét nghiệm).

7. Các yêu cầu về an toàn:
Tuân thủ các yêu cầu về an toàn sinh học cho người thực hiện và môi trường làm việc:
- Nơi thực hiện xử lý‎ mẫu phải được cách ly với khu vực bàn giấy văn phòng.
- Người thực hiện trong quá trình làm việc phải có quần áo, mũ, khẩu trang, găng tay y tế.
- Các dụng cụ (ăng cấy, pipet…) hoặc được đốt qua đèn cồn hoặc phải được ngâm trong dung dịch khử trùng ngay sau khi thực hiện hoặc bỏ ngay vào túi rác chuyên dụng.
- Lau dọn vệ sinh khử trùng khu vực xử lý mẫu bệnh phẩm bằng hóa chất thích hợp ngay sau khi kết thúc xét nghiệm.

8. Chất thải phát sinh và phương pháp xử lý (tóm tắt):
- Bệnh phẩm và/hoặc chất đựng bệnh phẩm, dụng cụ xét nghiệm dùng 1 lần: sau khi xét nghiệm xong phải được cho vào thùng khử trùng chuyên dụng để khử trùng trước khi thải bỏ.
- Môi trường nuôi cấy bệnh phẩm: sau khi đã có kết quả phân lập phải được tập trung vào các thùng đựng chuyên dụng để hấp sấy khử trùng.
9. Tài liệu tham khảo
1. Baron Ellen J.et all (1994) Streptococcal and Enterococcal Infections and Diseases. Medical Microbiology: a Short course. Wiley-Liss Inc, USA.
2. Kathryn L. Ruoff. Streptococcus. Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. (1995) ASM Press. Washington, D.C, USA.
3. Keizo Matsumoto, Tsuyoshi Nagatake (1994). Clinical Microbiology of Respiratory Infections. Nagasaki University.
4. World Health Organization. Identification of Streptococcus pneumoniae.
Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by N. meningitidis, S. pneumoniae and H. influenzae. 1999. 27-30.


PGS. TS. Phan Lê Thanh Hương
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương