+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::KHU VỰC ĐIỀU HÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-1.html)
+--- Diễn đàn: Thắc mắc - Góp ý (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-4.html)
+--- Chủ đề: QUY TRÌNH NHUỘM XANH ALCIAN (theo Mowry,1960) (/thread-6562.html)
QUY TRÌNH NHUỘM XANH ALCIAN (theo Mowry,1960) - thuyvan.qy@gmail.com - 08-05-2017
I. NGUYÊN LÝ
Đây là kỹ thuật nhuộm xác định các loại chất nhầy khác nhau (loại axit, trung tính hoặc kiềm, thường được áp dụng cho các tổn thương đường tiêu hóa). Nguyên lý dựa vào tính chất thuốc nhuộm cation và hình thành các liên kết với các anion nhất định trong mô mang nhóm carboxyl hoặc nhóm sunfat, tạo nên các liên kết tĩnh điện cation-anion. Gốc photphat của axit nhân không sẵn sàng liên kết với thuốc nhuộm xanh alcian. Có thể nhuộm xanh alcian ở các độ pH khác nhau để phân biệt các chất nhầy axit.
II. TRANG THIẾT BỊ, VẬT TƯ
2.1. Phương tiện, hóa chất chung
- Dung dịch cố định bệnh phẩm.
- Cồn (700, 800, 950, 1000).
- Parafin.
- Albumin + glyxerin.
- Máy đo 70 và 560.
- Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).
- Phiến kính, lá kính.
- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
2.2. Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
- Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây): đỏ Congo, chlorit sodium, hydroxit sodium, alun hematoxylin.
III. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
1. Điều kiện phòng xét nghiệm: Nhiệt độ phòng từ 23 - 28 oC, độ ẩm 40 – 80%
2. Nhân viên thực hiện quy trình đã được đào tạo và đào lại hàng năm
3. Khi có kết qủa không phù hợp cần thực hiện lại xét nghiệm,
4. An toàn
- Thực hiện an toàn sinh học
- Thực hiện an toàn hóa chất
- Thực hiện an toàn toàn diện, an toàn cháy nổ trong phòng xét nghiệm
IV. QUY TRÌNH
1. Cố định
Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể đƣợc cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 -30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ. Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
2. Chuyển bệnh phẩm
3. Vùi parafin
4. Đúc khối parafin
5. Cắt và dán mảnh cắt
6. Nhuộm mảnh cắt
6.1. Chuẩn bị phẩm nhuộm
* Pha dung dịch xanh alcian 1% trong axit acetic3% (pH 2,5)
Xanh alcian 1g
Axit acetic 3% 100ml
Hòa tan xanh alcian trong axit acetic. Lọc trước khi sử dụng.
* Pha dung dịch xanh alcian 1% trong axit hydrochloric 0,1M (pH 1,0)
Xanh alcian 1g
Axit hydrochloric 0.1M 100ml
Hòa tan xanh alcian trong axit hydrochloric. Lọc trước khi sử dụng.
* Pha dung dịch natri cacbonat 0,3%
Natri cacbonat 0.3 g
Nƣớc cất 100ml
Hòa tan natri cacbonat trong nước cất, lắc đều cho đến khi tan hết.
6.2. Tiến hành kỹ thuật
1. Tẩy nến trong toluen 3 lần, mỗi lần 2 phút
2. Chuyển vào bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút
3. Rửa nƣớc chảy 5 phút
4. Đặt trong dung dịch axit acetic 3% trong 2 phút
5. Nhuộm trong dung dịch xanh alcian 1%: 30 phút
6. Rửa nƣớc chảy 5 phút
7. Để trong dung dịch natri cacbonat 0.3% trong 30 phút
8. Rửa nƣớc chảy 5 phút
9. Nhuộm nhân trong Hematoxylin Mayer : 7 phút
10. Rửa nƣớc chảy 5 phút
11. Loại nƣớc bằng cồn 80, 95°, 100°.
12. Làm trong qua 3 bể toluen.
13. Gắn lá kính bằng bôm Canada
V. KẾT QUẢ
Chất nhầy axit: màu xanh ngọc
Nhân tế bào: màu xanh nhạt
VI. NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
1. Những sai sót và xử trí khi nhuộm nói chung
- Mảnh cắt bị bong, gấp quá nhiều:
+ Có thể do cố định bệnh phẩm không tốt: không khắc phục được hoặc phải lấy bệnh phẩm mới và làm lại kỹ thuật.
+ Do cắt quá dày hoặc dán mảnh cắt không tốt: cắt và dán lại mảnh cắt, nhuộm lại.
+ Mảnh cắt bị rách, nhăn hoặc giãn quá mức: do cắt bị vấp hoặc do dàn mảnh cắt quá mức hoặc bàn hơ quá nóng. Cần điều chỉnh nhiệt độ và cắt nhuộm lại nếu cần.
- Nhân tế bào và chất nhày bắt màu yếu: tăng thời gian nhuộm.
- Nhiều bọt khí, hơi nước trong tiêu bản:gắn lá kính thật nhanh, ngay khi nhấc qua bể toluen, thực hiện kỹ thuật trong phòng khô (có điều hòa, máy hút ẩm, đặc biệt vào những khi thời tiết có độ ảm cao).
- Mảnh cắt bị khô, bay mất thuốc nhuộm, không đánh giá được: cần phủ kín mảnh cắt bằng lá kính, gắn đủ bôm hoặc chất gắn lá kính.
2. Những sai sót và xử trí khi nhuộm xanh alcian
- Chất nhầy axit không bắt màu: Kiểm tra lại để đánh giá chính xác độ pH của thuốc nhuộm.
- Tùy thuộc chất nhày axit loại nào sẽ bắt màu ở các độ pH 1 hay 2,5, nên phải đánh giá sự bắt màu chất nhày theo loại mô được nhuộm