+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Huyết học - Truyền máu (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-70.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-102.html)
+---- Chủ đề: Cấy hỗn hợp tế bào lympho (/thread-6508.html)
Cấy hỗn hợp tế bào lympho - tuyenlab - 04-25-2017
CẤY HỖN HỢP TẾ BÀO LYMPHO
MIXED LYMPHOCYTE CULTURE
I. NGUYÊN LÝ
Khi nuôi cấy tế bào lympho nếu trong môi trường có kháng nguyên lạ, tế bào lympho sẽ non hóa và nhân lên. Cấy hỗn hợp là đưa tế bào lympho của người cho đã bất hoạt bằng mitomicin C hoặc chiếu xạ cho tiếp xúc với tế bào lympho của người nhận. Nếu tế bào lympho của người nhận mẫn cảm hoặc phản ứng với kháng nguyên trên tế bào lympho của người cho càng mạnh thì số lượng tế bào lympho của người nhận non hóa và nhân lên càng nhiều. Tế bào nhân lên sử dụng các bazơ nitơ tự do để tổng hợp ADN. Do đó, có thể ước lượng được mức độ phản ứng bằng cách cho thêm [3H] thimidine (là một loại bazơ nitơ có gắn đồng vị phóng xạ) vào môi trường nuôi cấy để phân tích lượng chất đồng vị phóng xạ dùng để đánh dấu này được sử dụng khi tế bào lympho của người nhận nhân lên.
Cấy hỗn hợp lympho chủ yếu sử dụng trong việc đánh giá mức độ hòa hợp kháng nguyên của người cho và người nhận trước khi ghép tạng. Ngoài ra, nó có thể được sử dụng để nghiên cứu các đáp ứng miễn dịch ở mức độ tế bào.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được chỉ định trong trường hợp cần đánh giá mức độ hòa hợp kháng nguyên của người cho và người nhận trước khi ghép tạng.III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.IV. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm đã được đào tạo kỹ thuật XN miễn dịch – di truyền.2. Phương tiện - Hóa chất
2.1. Phương tiện- Thiết bị: tủ ấm CO2, máy ly tâm lạnh, máy đếm phóng xạ nhấp nháy lỏng, kính hiển vi đảo ngược, pipet man.
- Dụng cụ: Ống nghiệm vô trùng, đĩa nuôi cấy 96 giếng 0,2 ml, bơm kim tiêm, đầu côn lọc.
2.2. Hóa chất
- Môi trường RF10-M: 100 ml bao gồm:+ 86 ml môi trường RPMI.
+ 10 ml huyết thanh bào thai bê.
+ 0.1 ml 2 – mercaptoethanol nồng độ 5x10-2 M.
+ 1 ml kháng sinh streptomycin 10mg/ml + penicilin 10,000UI/ml.
+ 1 ml L-glutamin 200 mM.
+ 2 ml Hepes buffer 1 M.
- [3H] thymidine.
- Lymphoprep.
V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
04 ml máu toàn phần của người bệnh cần ghép và người cho chống đông bằng heparin 5.000 đơn vị/ml.
2. Tiến hành kỹ thuật
- Tách tế bào lympho:
+ Chuẩn bị 2 ống nghiệm vô trùng có 2ml lymphoprep.
+ Cho 4 ml máu ngoại vi của người cho và người nhận vào 2 ống nghiệm trên.
+ Ly tâm tốc độ 2500 vòng/phút trong 15 phút để tách tế bào lympho.
+ Hút cẩn thận toàn bộ lớp tế bào đơn nhân ở giữa và cho vào 2 ống nghiệm vô trùng.
- Tái huyền dịch tế bào lympho vào môi trường RF10-M.
- Cho thêm 100 µl mitomycin C nồng độ 50 µg/ml vào ống nghiệm chứa tế bào lympho của người cho trong 20 phút để bất hoạt tế bào lympho.
- Cho thêm 2 ml RF10-M vào ống nghiệm đã được xử lý với mitomicin C. Ly tâm tốc độ1.000 vòng/ 10 phút và bỏ dịch nổi. Lặp lại bước rửa này 03 lần.
- Cho 100 µl huyền dịch tế bào lympho của người nhận có nồng độ tế bào 2 x 10^5 /ml vào giếng của phiến nuôi cấy 96 giếng (cho vào 3 giếng).
- Cho tiếp 100 µl huyền dịch tế bào lympho đã bất hoạt của người cho có nồng độ tế bào 5 x 10^6 (cả 3 giếng nêu trên).
- Cho 200 µl huyền dịch tế bào lympho của người nhận có nồng độ tế bào 2 x 10^5 /ml vào giếng thứ 4 của phiến nuôi cấy 96 giếng làm chứng âm.
- Đặt phiến nuôi cấy vào tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong 78 giờ.
- Cho 1 µCi [3H] Thymidine vào mỗi giếng (cả 4 giếng nêu trên), đặt phiến nuôi cấy vào tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong 18 giờ.
- Thu hoạch tế bào và đọc kết quả trên máy đếm nhấp nháy lỏng theo cơ chế đơn vị đếm được tính theo đơn vị phóng xạ (cpm).
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Sử dụng phần mềm phân tích kết quả đối chiếu giữa các giếng chứng và giếng thực nghiệm.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Không đảm bảo vô trùng: Cần thao tác và chuẩn bị dụng cụ, môi trường vô khuẩn, khử khuẩn khu vực thực hiện ít nhất 15 phút trước khi thực hiện kỹ thuật.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Greg A. Perry, (1976), “ Mixed Lymphocyte culture”, Creigton university.
2. John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, (1991), Current protocols in immunology, John Wiley & Son Press.