Xét nghiệm Gen bằng kỹ thuật FISH - Phiên bản có thể in +- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan) +-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html) +--- Diễn đàn: Huyết học - Truyền máu (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-70.html) +---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-102.html) +---- Chủ đề: Xét nghiệm Gen bằng kỹ thuật FISH (/thread-6215.html)

Xét nghiệm Gen bằng kỹ thuật FISH - tuyenlab - 09-21-2016 XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT FISH (Fluorescence in situ hybridization) GENE ANALYSIS BY FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION       I. NGUYÊN LÝ Kỹ thuật FISH được tiến hành dựa trên cơ sở của phản ứng lai ghép. Trong tế bào, phân tử ADN tồn tại dưới dạng phân tử kép gồm 2 chuỗi đơn gắn kết bổ sung với nhau thông qua liên kết hydro. Liên kết hydro là liên kết yếu nên dễ dàng bị đứt gãy dưới tác động của nhiệt độ hay pH cao. Lúc đó, phân tử ADN bị tách thành 2 chuỗi đơn. Tuy nhiên khi nhiệt độ hay pH giảm, các chuỗi đơn lại ghép nhau theo nguyên tắc bổ sung. Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH sử dụng các probe là đoạn ADN đặc hiệu có gắn huỳnh quang để lai ghép với các đoạn ADN tương đồng trên nhiễm sắc thể. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện bất thường nhiễm sắc thể một cách chính xác và nhanh chóng. II. CHỈ ĐỊNH Xét nghiệm này được chỉ định ở giai đoạn chẩn đoán bệnh hoặc giai đoạn theo dõi điều trị bệnh cho tất cả người bệnh mắc bệnh máu ác tính liên quan đến các bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu. III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH Không có chống chỉ định.   IV. CHUẨN BỊ 1. Người thực hiện Kỹ thuật viên xét nghiệm Di truyền - Sinh học phân tử đã được đào tạo.   2. Phương tiện, hóa chất   2.1. Phương tiện - Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly tâm, máy trộn mẫu, và kính hiển vi huỳnh quang; - Dụng cụ: kẹp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22, pipetman 100 μl, 10 μl, xi măng cao su, ống đong, giấy thấm.   2.2. Hóa chất - Probe phù hợp tương ứng với đoạn gen cần phát hiện; - Dung dịch 10% formamide: 5 ml formamide + 30 ml H2O + 15 ml 20X SSC; - Dung dịch 2X SSC; - Dung dịch rửa 0,1% NP40: 2X SSC + 0,1% NP40; - Dung dịch rửa 0,3% NP-40: 0,4X SSC + 0,3% NP40; - Cồn 70o, 85o, 100o.   3. Bệnh phẩm 2ml máu ngoại vi hoặc dịch hút tủy xương được đựng trong bơm tiêm có tráng chất chống đông heparin 5.000 đơn vị/ml. V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 1. Lấy bệnh phẩm - 2ml máu ngoại vi hoặc dịch hút tủy xương được đựng trong bơm tiêm có tráng chất chống đông heparin 5.000 đơn vị/ml. Máu hoặc tủy xương được nuôi cấy trong 24 giờ. - Sau 24 giờ, tiến hành thu hoạch huyền dịch tế bào.   2. Tiến hành kỹ thuật 2.1. Chuẩn bị tiêu bản - Nếu sử dụng kỹ thuật FISH trên các cụm kỳ giữa (metaphase) thì cần nuôi cấy và chuẩn bị tiêu bản như kỹ thuật xét nghiệm công thức nhiễm sắc thể. Trong trường hợp sử dụng trên nhân tế bào thì có thể bỏ qua bước nuôi cấy. - Nhỏ huyền dịch tế bào lên tiêu bản. Yêu cầu: hình thái nhân rõ ràng, tế bào dàn đều, các cụm nhiễm sắc thể kỳ giữa to và bung đẹp. - Dùng bút kim cương đánh dấu trên bề mặt tiêu bản những vùng đáp ứng được yêu cầu trên. 2.2. Rửa tiêu bản - Ngâm tiêu bản vào dung dịch 2X SSC ở 37±1oC trong 15 phút; - Rửa tiêu bản qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ phòng trong 5 phút; - Chuyển tiêu bản qua cóng chứa dung dịch formaldehyde 10% ở nhiệt độ phòng trong 5 phút; - Rửa tiêu bản qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ phòng trong 5 phút; - Chuyển tiêu bản qua cóng chứa cồn 70o trong 1 phút; - Chuyển tiêu bản qua cóng chứa cồn 85o trong 1 phút; - Chuyển tiêu bản qua cóng chứa cồn 100o trong 1 phút; - Để tiêu bản khô hoàn toàn ở nhiệt độ phòng.   2.3. Chuẩn bị probe - Trộn đều các dung dịch sau trong 1 ống PCR (1 μl probe + 7 μl LSI + 2μl dH2O) /1tiêu bản. - Ly tâm nhẹ.   2.4. Lai - Nhỏ 10 μl  dung dịch probe vào khu vực đánh dấu trên tiêu bản sau đó che phủ bằng coverslip. Yêu cầu: dung dịch probe thấm đều trên tiêu bản, không có bọt khí. - Phủ kín coverslip bằng cao su xi măng. - Đặt tiêu bản vào máy lai, chọn chương trình biến tính ở 73oC trong 3 phút và ủ 37oC trong 16 - 20 giờ.   2.5. Rửa sau khi lai - Gỡ bỏ xi măng cao su và coverslip; - Ngâm và lắc mạnh tiêu bản lần lượt qua các cóng Coplin sau. + Dung dịch (0,4X SSC/ 0.3% NP40): 2 phút, 73oC; + Dung dịch (2X SSC/ 0,1% NP40): 1phút, nhiệt độ phòng. - Làm khô tiêu bản.   2.6. Chống mất màu probe - Nhỏ 10-20 μl   dung dịch DAPI/antifade (1:20) lên bề mặt tiêu bản để chống mất màu probe và nhuộm nhân tế bào. - Phủ kín tiêu bản bằng coverslip. Yêu cầu: dung dịch dàn đều trên tiêu bản và không có bọt khí   VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ - Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, với kỹ thuật dual colour FISH, chúng ta sẽ thấy 3 màu. + Màu xanh da trời đậm: màu nhân tế bào + Màu xanh lá cây: màu của probe + Màu đỏ: màu của probe - Nguyên tắc phân tích kết quả được liệt kê trong bảng sau    VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ