+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Huyết học - Truyền máu (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-70.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-102.html)
+---- Chủ đề: Định tính kháng thể kháng nhân bằng kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA) (/thread-6182.html)
Định tính kháng thể kháng nhân bằng kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA) - tuyenlab - 08-22-2016
ĐỊNH TÍNH KHÁNG THỂ KHÁNG NHÂN BẰNG KỸ THUẬT
MIỄN DỊCH GẮN MEN (ELISA)
(Anti Nuclear Antibody -ANA qualitative test by ELISA)
I. NGUYÊN LÝ
Kháng nguyên nhân (nuclear antigen) được gắn sẵn trong các giếng nhựa sẽ kết hợp với kháng thể đặc hiệu kháng nhân (anti nuclear antibodies) lớp IgG và IgM (nếu có) trong huyết thanh người bệnh khi ủ tạo nên phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể. Sau khi rửa bỏ huyết thanh thừa, cho chất cộng hợp (còn gọi là conjugate) có bản chất là hỗn hợp anti IgG và anti IgM người gắn enzym peroxidase. Khi đó cộng hợp sẽ gắn đặc hiệu vào phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể (nếu có). Sau khi rửa bỏ lượng cộng hợp dư thừa không gắn với phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể, cho tiếp vào giếng phản ứng một lượng xác định cơ chất TMB/H2O2 . Enzym peroxidase trong giếng phản ứng (nếu có) sẽ xúc tác tạo phản ứng giữa H2O2 và TMB tạo màu xanh lá cây. Phản ứng được ngừng lại bằng dung dịch a-xít H2SO4 loãng, lúc này màu xanh của dung dịch chuyển thành màu vàng chanh, đậm độ màu tương quan thuận với nồng độ kháng thể IgG và IgM có trong huyết thanh. Xác định mức độ màu bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 450 nm hoặc bước sóng kép 450 nm/620 nm.
II. CHỈ ĐỊNH
Các trường hợp nghĩ đến bệnh tự miễn.
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
IV. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
2. Phương tiện – Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Máy ly tâm ống máu;
- Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl;
- Dàn máy ELISA (tự động hoặc bán tự động);
- Găng tay.
2.2. Hóa chất
Kít định lượng ANA IgG/IgM gồm các thành phần sau:
- Dung dịch pha loãng mẫu;
- Dung dịch rửa;
- Chứng âm (negative control);
- Chứng dương (positive control);
- Chứng ngưỡng (cut-off calibrator);
- Dung dịch cộng hợp (conjugates) IgG và IgM;
- Cơ chất tạo mầu (TMB substrate);
- Dung dịch dừng phản ứng (stop solution);
- Các giếng phản ứng trên phiến nhựa ELISA.
- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.
3. Mẫu bệnh phẩm
- Mẫu dùng là huyết thanh.
- Cần tách huyết thanh càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản ứng.
- Nếu có lẫn hồng cầu hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
- Mẫu huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ 2oC đến 8oC có thể dùng làm xét nghiệm trong vòng 7 ngày. Nếu muốn để lâu hơn mới xét nghiệm cần phải bảo quản ở tủ lạnh sâu (≤ -20o C)Tuy nhiên với mẫu bảo quản lạnh sâu cần tránh đông-tan nhiều lần.
V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Pha loãng mẫu 100 lần bằng dung dịch pha loãng mẫu.
2. Nhỏ 100µl các mẫu chứng âm, chứng dương và mẫu thử vào các giếng tương ứng trên phiến theo sơ đồ định sẵn.
3. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
4. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.
5. Nhỏ 100µl cộng hợp (conjugate) IgG và IgM vào các giếng tương ứng.
6. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
7. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.
8. Nhỏ 100µl cơ chất tạo mầu (TMB subtrate) vào mỗi giếng.
9. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.
10. Nhỏ 100µl dung dịch dừng phản ứng (stop solution) vào mỗi giếng theo đúng trình tự nhỏ TMB.
11. Ủ tối thiểu 5 phút. Gõ nhẹ vào thành giếng trong 5 giây để trộn đều.
12. Đọc phiến ở bước sóng 450/620 nm (tốt hơn thì dùng bước sóng kép 450/ 620 nm) trong vòng 30 phút sau khi ủ dung dịch ngừng phản ứng.
13. Phân tích kết quả.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Căn cứ vào mật độ quang đo được ở các giếng cut-of calibrator, chứng âm, chứng dương, và các mẫu thử để nhận định kết quả xét nghiệm như sau
+ Âm tính: ODmẫu < ODcut-off - 10%
+ Dương tính: ODmẫu < ODcut-off + 10%
+ Vùng xám: ODcut-off - 10% < ODmẫu < ODcut-off + 10%
- Giá trị biện luận: Bình thường mẫu âm tính. Nếu mẫu dương tính chứng tỏ trong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể tự miễn kháng nhân tế bào (ANA). Nếu mẫu trong khoảng nghi ngờ (vùng xám), cần xét nghiệm lại sau 1-3 tháng.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất, máu bị đông.
Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại thông tin trên giấy chỉ định và trên ống máu, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
- Sai sót do nhỏ mẫu vào phiến phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu phân tích.
Xử trí: Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi nhỏ mẫu.
- Chứng dương âm tính hoặc chứng âm dương tính. Nếu xảy ra đều không dùng kết quả này được. Nguyên nhân có thể do hóa chất không đảm bảo chất lượng, do không thực hiện đủ và đúng các bước trong quy trình xét nghiệm, nhiệt độ phản ứng không phù hợp, thực hiện bước rửa kém hiệu quả.
Xử trí: làm lại xét nghiệm, kiểm tra chỉ dùng hóa chất còn hạn sử dụng và được bảo quản đúng điều kiện theo hướng đãn của nhà sản xuất, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét nghiệm (25-30o C).
Theo quyết định số: 2017/QĐ-BYT ngày 09 tháng 06 năm 2014