+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Hóa sinh - Miễn dịch (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-11.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-100.html)
+---- Chủ đề: Định lượng TGF-β2 bằng kỹ thuật ELISA (/thread-6029.html)
Định lượng TGF-β2 bằng kỹ thuật ELISA - tuyenlab - 06-01-2016
ĐỊNH LƯỢNG TGF-β2
(Transforming Growth Factor β2)
TGF-β2 là một polypeptid chứa 412 axit amin. Yếu tố chuyển đổi tăng trưởng β (TGF-β) được sản xuất bởi nhiều tế bào và các loại mô, ví dụ tiểu cầu, mô xương, nhau thai và thận. Tuy nhiên, TGF-β2 không được sản xuất bởi các tiểu cầu, trái với TGF-β1. Nó điều chỉnh sự phát triển phôi thai, hình thành xương, phát triển vú, chữa lành vết thương, tạo máu. TGF-β2 đã được chứng minh là một yếu tố ức chế sự tăng trưởng mạnh trong điều hòa tế bào thần kinh tiểu não và tăng sinh nguyên bào thần kinh tiểu não sau sinh. TGF-β2 còn được phát hiện trong dịch nước mắt.
I. NGUYÊN LÝ
Dùng kỹ thuật ELISA để định lượng TGF-β2 trong huyết tương, huyết thanh và phần nổi nuôi cấy tế bào.
Dựa vào tính đặc hiệu của kháng nguyên - kháng thể theo phương pháp sandwich: trước khi làm xét nghiệm, standard và mẫu người bệnh được hòa loãng với dung dịch đệm, axit hóa với HCl, rồi trung hòa với NaOH. Sau đó, các mẫu được ủ trong các giếng đã được phủ với kháng thể đa dòng TGF-β2. Sau khi rửa sạch các thành phần không kết hợp, Enzym liên hợp (kháng thể IgG chuột liên hợp biotin), phức hợp enzym (Streptavidin Peroxidase) lần lượt được thêm vào rồi được ủ. Một phức hợp sandwich enzym miễn dịch được hình thành. Sau khi rửa đi các thành phần không kết hợp, thêm cơ chất rồi dung dịch ngừng phản ứng vào. Đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ TGF-β2 trong mẫu, được đo ở bước sóng 450 nm.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Bác sĩ, cử nhân, kỹ thuật viên được đào tạo với máy Evolis Twin Plus
2. Phương tiện, hóa chất
- Máy phân tích ELISA (có thể Evolis Twin Plus)
- Thuốc thử được cung cấp của hãng DGR, Đức (EI -2396)
+ Đĩa phản ứng (96 giếng)
+ Enzym liên hợp
+ Chuẩn: 1 lọ
+ Cơ chất
+ Dung dịch đệm
+ Dung dịch rửa
+ HCL 1 N
+ Dung dịch ngừng phản ứng
+ NaOH 1 N
+ Phức hợp enzym
- Thuốc thử và dụng cụ cần nhưng không được cung cấp
+ Pipet chính xác
+ Các tube
+ Đầu côn pipet dùng một lần
+ Nước cất
+ Giấy chỉ thị màu
+ Control 2 mức thấp và cao
3. Người bệnh
Người bệnh không cần nhịn đói và không có yêu cầu gì đặc biệt khác
4. Phiếu xét nghiệm
Phiếu xét nghiệm theo mẫu bệnh viện và Bộ Y tế quy định, có ghi đầy đủ thông
tin người bệnh.
III. Các bước tiến hành
1. Lấy bệnh phẩm
- Thu thập mẫu
Sử dụng huyết thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, citrate hoặc chất nổi trong nuôi cấy tế bào
+ Huyết thanh: để co cục máu, ly tâm ở nhiệt độ phòng
+ Huyết tương: ly tâm ngay sau khi thu thập
Mẫu được tách tube và ổn định ở 2 – 8o C trong 24 giờ, lâu hơn thì làm đông ở -20o C. Mẫu sau khi rã đông nên votex trước khi làm.
- Xử lý mẫu
+ Huyết thanh và huyết tương
Hòa loãng mẫu với dung dịch đệm theo tỉ lệ 1:50 (ví dụ: 10 μl mẫu + 490 μl dung dịch đệm).
+ Mẫu tế bào nuôi cấy
Ly tâm mẫu, hòa loãng mẫu với dung dịch đệm theo tỉ lệ 1:10 (ví dụ: 10 μl mẫu + 90 μl dung dịch đệm).
- Axit hóa và trung hòa mẫu và chuẩn:
+ Thêm 200 μl calibrator, control hoặc mẫu đã hòa loãng vào tube phản ứng.
+ Thêm 20 μl HCl 1N vào
+ Đậy nắp, trộn đều và để trong 15 phút
+ Thêm 20 μl NaOH 1N để trung hòa, trộn đều.
+ Sau khi trung hòa, các mẫu nên có giá trị pH từ 7 và 8. Vì vậy hãy kiểm tra giá trị pH với giấy chỉ thị màu.
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Chuẩn bị thuốc thử
Đưa tất cả thuốc thử về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
2.1.1. Dung dịch rửa:
Hòa 30 ml dung dịch rửa với 1170 ml nước cất để được dung dịch 600 ml.
Sau khi pha, ổn định 2 tuần ở nhiệt độ phòng.
2.1.2. Chuẩn:
- Lọ chuẩn gốc có nồng độ 1000 pg/mL
- Pha loãng nhiều lần với dung dịch đệm để được chẩn B, C, D, E, F với các nồng độ lần lượt tương ứng là 500 pg/mL; 250 pg/mL; 125 pg/mL; 62,5 pg/mL; 31,25 pg/mL và G là dung dịch đệm (0 pg/mL)
- Ổn định 1 tuần khi bảo quản ở 2 – 8o C, lâu hơn khi làm đông ở - 20o C
2.2. Tiến hành
- Tiến hành theo quy trình cài đặt trên máy tự động EVOLIS TWIN PLUS.
- Tổng thời gian làm xét nghiệm này khoảng 355 phút (gần 6 giờ)
- Vẽ đường cong chuẩn trước, control đạt thì tiến hành đo mẫu.
Các bước tiến hành như sau:
+ Hút 100 μl mỗi calibrator, control hoặc mẫu người bệnh vào các giếng
+ Phủ giấy kín và ủ 3 giờ ở nhiệt độ phòng
+ Lấy giấy phủ ra, loại bỏ các chất ra khỏi giếng, rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa
+ Hút 100 μl enzym liên hợp vào mỗi giếng
+ Ủ 120 phút ở nhiệt độ phòng
+ Loại bỏ các chất ra khỏi giếng, rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa
+ Hút 100 μl phức hợp enzym vào mỗi giếng
+ Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng
+ Loại bỏ các chất ra khỏi giếng, rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa
+ Hút 100 μl cơ chất vào mỗi giếng
+ Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng
+ Hút 50 μl dung dịch ngừng phản ứng vào mỗi giếng, trộn đều
+ Tiến hành đo với bước sóng 450 nm trong khoảng 10 phút
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Mỗi phòng thí nghiệm nên xác định các giá trị riêng bình thường và bất thường của mình.
- Ý nghĩa lâm sàng: Nồng độ TGF-β2 tăng trong
+ Thủy tinh thể của người bệnh có bệnh lý võng mạc đái tháo đường tăng sinh.
+ Người bệnh có khối u ác tính.
+ Tăng nhiều trong dịch não thất ở bệnh Parkinson.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Có một số sai sót thường gặp:
- Lấy sai ống -> lấy lại
- Tuyệt đối không sử dụng máu vỡ hồng cầu, máu đục, máu vàng
- Mẫu máu ở người bệnh có dùng thuốc chống đông thì thời gian co cục máu lâu hơn trước khi ly tâm (hơn 30 phút)
- Những sai sót do máy thì hỏi kỹ sư để xử trí.
- Lưu ý Calibrator và QC bảo quản thật tốt để có đường cong chuẩn đạt yêu cầu.
Theo quyết định số: 320 /QĐ-BYT ngày 23 tháng 01 năm 2014