+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Hóa sinh - Miễn dịch (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-11.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-100.html)
+---- Chủ đề: Định lượng TGF-β1 bằng kỹ thuật ELISA (/thread-6028.html)
Định lượng TGF-β1 bằng kỹ thuật ELISA - tuyenlab - 06-01-2016
ĐỊNH LƯỢNG TGF-β1
(Transforming Growth Factor β1)
TGF-β1 là một polypeptid chứa 390 axit amin. Yếu tố chuyển đổi tăng trưởng β1, được sản xuất bởi nhiều tế bào và các loại mô, ví dụ như tiểu cầu, mô xương, nhau thai và thận. Điều chỉnh sự phát triển phôi thai, hình thành xương, phát triển vú, chữa lành vết thương, tạo máu. Đối với hệ thống miễn dịch, TGF-β1 ức chế tăng sinh tế bào T, tế bào B và như là một phân tử kháng viêm. TGF-β1 ngăn cản sự hình thành và hoạt hóa đại thực bào, ức chế hoạt động của các tế bào diệt tự nhiên, tế bào diệt kích hoạt lymphokin và sản xuất các cytokin.
I. NGUYÊN LÝ
Dùng kỹ thuật ELISA để định lượng TGF-β1 trong huyết tương, huyết thanh và phần nổi nuôi cấy tế bào.
Dựa vào tính đặc hiệu của kháng nguyên-kháng thể theo phương pháp sandwich: trước khi làm xét nghiệm, standard và mẫu người bệnh được hòa loãng với dung dịch đệm, axit hóa với HCl, rồi trung hòa với NaOH. Sau đó, các mẫu được ủ trong các giếng đã được phủ với kháng thể đa dòng TGF-β1. Sau khi rửa sạch các thành phần không kết hợp, kháng huyết thanh (kháng thể đơn dòng chuột), rồi Enzym liên hợp (kháng thể IgG chuột liên hợp biotin), phức hợp enzym (Streptavidin Peroxidase) lần lượt được thêm vào rồi được ủ. Một phức hợp sandwich enzym miễn dịch được hình thành. Sau khi rửa đi các thành phần không kết hợp, thêm cơ chất rồi dung dịch ngừng phản ứng vào. Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ total TGF-β1 trong mẫu, được đo ở bước sóng 450 nm.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Bác sĩ, cử nhân, kỹ thuật viên được đào tạo với máy Evolis Twin Plus.
2. Phương tiện, hóa chất
- Máy phân tích ELISA (có thể Evolis Twin Plus)
- Thuốc thử được cung cấp của hãng DRG, Đức (EI -1864)
+ Đĩa phản ứng (96 giếng)
+ Enzym liên hợp
+ Chuẩn: 1 lọ
+ Cơ chất
+ Dung dịch đệm
+ Dung dịch rửa
+ HCL 1 N
+ Dung dịch ngừng phản ứng
+ NaOH 1 N
+ Kháng huyết thanh
+ Phức hợp enzym
- Thuốc thử và dụng cụ cần nhưng không được cung cấp
+ Pipet chính xác
+ Các tube
+ Đầu côn pipet dùng một
+ Nước cất
+ Giấy chỉ thị màu
+ Control mức thấp và cao
3. Người bệnh
- Người bệnh không cần nhịn đói và không có yêu cầu gì đặc biệt khác
- Một số đối tượng mà BS thường chỉ định xét nghiệm này: người bệnh suy thận mạn, suy thận cấp, người bệnh ghép thận…
4. Phiếu xét nghiệm
Phiếu xét nghiệm theo mẫu bệnh viện và Bộ Y tế quy định, có ghi đầy đủ thông tin người bệnh.
III. Các bước tiến hành
1. Lấy bệnh phẩm
- Thu thập mẫu
Sử dụng huyết thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, citrate hoặc chất nổi trong nuôi cấy tế bào
+ Huyết thanh: để co cục máu, ly tâm ở nhiệt độ phòng
+ Huyết tương: ly tâm ngay sau khi thu thập
Mẫu được tách tube và ổn định ở 2 - 8o C trong 24 giờ, lâu hơn thì làm đông ở -20o C. Lắc đều mẫu sau khi rã đông.
- Xử lý mẫu
+ Huyết thanh và huyết tương
Hòa loãng mẫu với dung dịch đệm theo tỉ lệ 1:50 (ví dụ:10 μl mẫu + 490 μl dung dịch đệm )
+ Mẫu tế bào nuôi cấy
Ly tâm mẫu, hòa loãng mẫu với dung dịch đệm theo tỉ lệ 1:10 (ví dụ: 10 μl mẫu + 90 μl dung dịch đệm).
- Axit hóa và trung hòa mẫu và chuẩn:
.+ Thêm 200 μl chuẩn hoặc mẫu đã hòa loãng vào tube phản ứng.
+ Thêm 20 μl HCl 1N vào
+ Đậy nắp, trộn đều và để trong 15 phút
+ Thêm 20 μl NaOH 1N để trung hòa, trộn đều.
+ Sau khi trung hòa, các mẫu nên có giá trị pH từ 7 và 8. Vì vậy hãy kiểm tra giá trị pH với giấy chỉ thị màu.
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Chuẩn bị thuốc thử
Đưa tất cả thuốc thử về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
2.1.1. Dung dịch rửa:
Hòa 30 ml dung dịch rửa với 1170 ml nước cất để được dung dịch 1200 ml. Sau khi pha, ổn định 2 tuần ở nhiệt độ phòng.
2.1.2. Chuẩn:
- Lọ chuẩn gốc có nồng độ 600 pg/mL.
- Pha loãng nhiều lần với dung dịch đệm để được chuẩn B,C,D,E,F với các nồng độ tương ứng là 300 pg/mL; 150 pg/mL; 75 pg/mL; 38 pg/mL; 19 pg/mL và G là dung dịch đệm (0 pg/mL).
- Ổn định 1 tuần khi bảo quản ở 2- 8o C, lâu hơn khi làm đông ở -20o C.
2.2. Tiến hành
- Tiến hành theo quy trình cài đặt trên máy tự động EVOLIS TWIN PLUS.
- Tổng thời gian làm xét nghiệm này khoảng 1275 phút (gần 21 giờ) nếu ủ ở 4° C và khoảng 555 phút (gần 9 giờ) nếu ủ ở nhiệt độ phòng.
- Vẽ đường cong chuẩn trước, control đạt thì tiến hành đo mẫu. Các bước tiến hành như sau:
+ Hút 100 μl mỗi calibrator, control hoặc mẫu người bệnh vào các giếng.
+ Phủ giấy kín và ủ qua đêm (8 - 16 giờ) ở 4° C. Hoặc ủ 3 giờ ở nhiệt độ phòng.
+ Lấy giấy phủ ra, loại bỏ các chất ra khỏi giếng, rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa.
+ Hút 100 μl kháng huyết thanh vào mỗi giếng.
+ Ủ 120 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Loại bỏ các chất ra khỏi giếng, rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa.
+ Hút 100 μl enzym liên hợp vào mỗi giếng.
+ Ủ 45 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Loại bỏ các chất ra khỏi giếng, rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa.
+ Hút 100 μl phức hợp enzym vào mỗi giếng.
+ Ủ 45 phút ở nhiệt độ phòng
+ Loại bỏ các chất ra khỏi giếng, rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa
+ Hút 100 μl cơ chất vào mỗi giếng
+ Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng
+ Hút 50 μl dung dịch ngừng phản ứng vào mỗi giếng, trộn đều.
+ Tiến hành đo với bước sóng 450 nm trong 10 phút.
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Giá trị tham khảo: < 25000 pg/mL (25 ng/mL).
- Mỗi phòng thí nghiệm nên xác định các giá trị riêng.
- Ý nghĩa lâm sàng: TGF-β1 tăng trong ung thư, suy thận mạn, suy thận cấp…
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Có một số sai sót thường gặp:
- Lấy sai ống -> lấy lại
- Tuyệt đối không sử dụng máu vỡ hồng cầu, máu đục, máu vàng
- Mẫu máu ở người bệnh có dùng thuốc chống đông thì thời gian co cục máu lâu hơn trước khi ly tâm (hơn 30 phút)
- Những sai sót do máy thì hỏi kỹ sư để xử trí.
- Lưu ý Calibrator và QC bảo quản thật tốt để có đường cong chuẩn đạt yêu cầu.
Theo quyết định số: 320 /QĐ-BYT ngày 23 tháng 01 năm 2014