+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Hóa sinh - Miễn dịch (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-11.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-100.html)
+---- Chủ đề: Định lượng MDA bằng kỹ thuật ELISA (/thread-5969.html)
Định lượng MDA bằng kỹ thuật ELISA - tuyenlab - 04-27-2016
ĐỊNH LƯỢNG MDA (Malondialdehyde)
Malondialdehyde (MDA) là một hợp chất hữu cơ với công thức.
CH2 (CHO)2. Loại phản ứng này xảy ra tự nhiên và là một dấu ấn sinh học của tình trạng stress oxy hóa. MDA được tạo ra từ các phản ứng oxy hóa acid béo không bão hòa. MDA phản ứng với deoxyadenosine và deoxygua- nosine trong ADN, tạo thành các sản phẩm, chủ yếu là M1G gây đột biến.
I. NGUYÊN LÝ
Dùng kỹ thuật ELISA để định lượng MDA trong huyết thanh và huyết tương người
Dựa vào tính đặc hiệu của kháng nguyên - kháng thể, theo phương pháp cạnh tranh: các giếng được phủ bởi kháng thể đặc hiệu cho MDA. Standard, control và mẫu được thêm vào các giếng cùng với HRP-liên hợp rồi được ủ. Một phản ứng cạnh tranh xảy ra giữa MDA (trong mẫu, standard, control) và HRP-liên hợp để kết hợp với kháng thể phủ trên giếng. Lượng MDA trong mẫu càng nhiều thì lượng kháng thể kết hợp với HRP-liên hợp càng ít. Sau đó cơ chất được thêm vào giếng, rồi dung dịch ngừng phản ứng được thêm vào.
Đậm độ màu tỉ lệ nghịch với nồng độ MDA trong mẫu thử, được đo với bước sóng 450 nm.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Bác sĩ, cử nhân, kỹ thuật viên được đào tạo với máy Evolis Twin Plus
2. Phương tiện, hóa chất
- Máy phân tích ELISA (có thể Evolis Twin Plus)
- Thuốc thử được cung cấp của hãng Cusabio (CSB-E08557h)
+ Đĩa phản ứng (96 giếng)
+ Cơ chất
+ Chuẩn (S1- S5): 1ml
+ Cơ chất B
+ HRP-liên hợp
+ Dung dịch ngừng phản ứng
+ Dung dịch rửa
Trong đó: HRP(horseradish peroxidase) là chất đánh dấu
- Thuốc thử và dụng cụ cần nhưng không được cung cấp
+ Pipet chính xác
+ Các tube
+ Đầu côn pipet dùng một lần
+ Nước cất
+ Control mức cao và mức thấp
1. Người bệnh
Người bệnh không cần nhịn đói hay yêu cầu đặc biệt gì
2. Phiếu xét nghiệm
Phiếu xét nghiệm theo mẫu bệnh viện và Bộ Y tế qui định, có ghi đầy đủ thông tin người bệnh.
III. Các bước tiến hành
1. Lấy bệnh phẩm
- Sử dụng huyết thanh hoặc huyết tương chống đông bằng citrate, EDTA, heparin.
- Huyết thanh : sau khi lấy mẫu thì để 30 phút, co cục máu, sau đó ly tâm 3000 vòng/10 phút. Tách ngay ra tube và bảo quản ở - 20o C. Ly tâm lại sau khi làm rã đông mỗi khi chạy mẫu. Chỉ rã đông một lần.
- Huyết tương: tương tự như trên nhưng phải ly tâm ngay sau khi lấy mẫu, không để quá 30 phút.
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Chuẩn bị thuốc thử
Đưa tất cả thuốc thử về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
2.1.1. Dung dịch rửa:
Hòa 15 ml Wash Buffer với nước cất để được dung dịch 300 ml.
2.1.2. Chuẩn:
- Nồng độ S1- S5 lần lượt là: 40μg/L; 10 μg/L; 2 μg/L; 0,4 μg/L; 0,1 μg/L
- Sẵn sàng để sử dụng.
- Tiến hành theo quy trình cài đặt trên máy tự động EVOLIS TWIN PLUS.
- Tổng thời gian hoàn thành xét nghiệm này khoảng 100 phút
- Vẽ đường cong chuẩn trước, control đạt thì tiến hành đo mẫu.
2.2. Các bước tiến hành
- Hút 50 μl mỗi calibrator, control hoặc mẫu người bệnh vào các giếng
- Hút 50 μl HRP-liên hợp cho vào tiếp các giếng trộn đều
- Ủ 60 phút ở 37o C
- Rửa các giếng 3 lần với 200 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa
- Hút 50 μl cơ chất A và cơ chất B vào mỗi giếng
- Ủ 15 phút ở 37o C, tránh ánh sáng
- Hút 50 μl dung dịch ngừng phản ứng vào mỗi giếng
- Tiến hành đo trong vòng 10 phút.
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Giá trị tham khảo:
Người lớn: 0,78 – 19,27 μg/L
- Ý nghĩa lâm sàng:
+ MDA là dấu ấn của tình trạng chống oxi hóa ở những người bệnh ung thư.
+ MDA tăng trong tiền ung thư và các người bệnh ung thư so với những người bình thường khỏe mạnh.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Có một số sai sót thường gặp:
- Lấy sai ống -> lấy lại.
- Tuyệt đối không sử dụng máu vỡ hồng cầu, máu đục, máu vàng.
- Mẫu máu ở người bệnh có dùng thuốc chống đông thì thời gian co cục máu lâu hơn trước khi ly tâm (hơn 30 phút).
- Mẫu có kết quả vượt quá 40μg/L thì phải hòa loãng mẫu với nước cất.
- Những sai sót do máy thì hỏi kỹ sư để xử trí.
- Lưu ý Calibrator và QC bảo quản thật tốt để có đường cong chuẩn đạt yêu cầu.
Theo quyết định số: 320 /QĐ-BYT ngày 23 tháng 01 năm 2014