+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Hóa sinh - Miễn dịch (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-11.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-100.html)
+---- Chủ đề: ĐỊnh lượng LP – PLA2 bằng kỹ thuật ELISA (/thread-5968.html)
ĐỊnh lượng LP – PLA2 bằng kỹ thuật ELISA - tuyenlab - 04-27-2016
ĐỊNH LƯỢNG LP – PLA2
(Lipoprotein - asociated phospholipase A2)
Lp-PLA2 là một lipoprotein kết hợp với phopholipase A2 (Lp-PLA2) có trọng lượng phân tử 45 kDa, gồm 441 axit amin. Trong máu, nó di chuyển chủ yếu dưới dạng kết hợp lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL). Dưới 20% được kết hợp với lipoprotein tỷ trọng cao (HDL). Nó là một loại enzyme được sản xuất bởi các tế bào viêm và thủy phân phospholipids trong LDL. Nó như một chỉ điểm viêm đặc hiệu cho mạch máu, có liên quan đến sự hình thành các mảng xơ vữa giòn, dễ vỡ.
I. NGUYÊN LÝ
Dùng kỹ thuật ELISA để định lượng Lp-PLA2 trong huyết thanh và huyết tương người.
Dựa vào tính đặc hiệu của kháng nguyên-kháng thể, theo phương pháp sandwich: các giếng được phủ kháng thể đặc hiệu cho Lp-PLA2 người. Standard, mẫu và Biotin-kháng thể được thêm vào, Lp-PLA2 trong mẫu kết hợp với kháng thể phủ trên giếng và Biotin-kháng thể mới được thêm vào. Sau khi rửa đi các Biotin-kháng thể không kết hợp, HRP- Avidin liên hợp được thêm vào. Tiếp sau khi các giếng được rửa lần hai, cơ chất TMB được thêm vào giếng. Tiếp theo, dung dịch ngừng phản ứng thêm vào sẽ chuyển từ màu xanh sang vàng, đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ Lp- PLA2 trong mẫu thử, được đo ở bước sóng 450 nm.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Bác sĩ, cử nhân, kỹ thuật viên được đào tạo với máy Evolis Twin Plus
2. Phương tiện, hóa chất
- Máy phân tích ELISA (có thể Evolis Twin Plus)
- Thuốc thử được cung cấp của hãng Cusabio (CSB-E08319h)
- Đĩa phản ứng (96 giếng)
- Biotin-kháng thể
- Chuẩn (dạng đông khô)
- Avidin-HRP
- Dung dich hòa loãng mẫu
- Dung dịch rữa
- Dung dịch hòa loãng Biotin-kháng thể
- Cơ chất TMB
- Dung dịch hòa loãng Avidin-HRP
- Dung dịch ngừng phản ứng
Trong đó: Avidin-HRP là Avidin liên kết với HRP (Horseradish Peroxidase). TMB: 3,3’,5,5’ tetramethyl-benzidine.
- Thuốc thử và dụng cụ cần nhưng không được cung cấp
+ Pipet chính xác + Các tube
+ Đầu côn pipet dùng một lần + Nước cất
+ Control mức cao và thấp
3. Người bệnh
- Không cần nhịn đói hay yêu cầu đặc biệt gì khác.
- Một số đối tượng mà BS thường chỉ định xét nghiệm này: Người bệnh tai biến mạch máu não, rối loạn Lipid máu, tăng huyết áp, nhồi máu cơ tim, đột quỵ…
4. Phiếu xét nghiệm
Phiếu xét nghiệm theo mẫu bệnh viện và Bộ Y tế quy định, có ghi đầy đủ thông tin người bệnh.
III. Các bước tiến hành
1. Lấy bệnh phẩm
- Sử dụng huyết thanh hoặc huyết tương chống đông bằng citrate, EDTA, heparin.
- Huyết thanh : sau khi lấy mẫu thì để 30 phút, co cục máu, rồi ly tâm 3000 vòng/phút x 10 phút. Tách ngay ra tube và bảo quản ở - 20o C. Khi chạy mẫu thì ly tâm lại sau khi làm rã đông. Chỉ rã đông một lần.
- Huyết tương: tương tự như trên nhưng phải ly tâm ngay sau khi lấy mẫu, không để quá 30 phút.
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Chuẩn bị thuốc thử
Đưa tất cả thuốc thử về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
2.1.1. Dung dịch rửa
Hòa 20 ml dung dịch rửa với nước cất để được dung dịch 500 ml.
2.1.2. Chuẩn (S0-S7)
- Ly tâm lọ chuẩn (dạng đông khô) với tốc độ 6000 vòng / phút trong 30 giây.
- Thêm 1ml dung dịch hòa loãng vào lọ chuẩn (dạng đông khô) để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 200 IU/mL (S7), để ít nhất 15 phút, lắc đều.
- Hòa tiếp nhiều lần để được các dung dịch chuẩn trực dụng (S6-S1) có nồng độ lần lượt là 100 IU/mL; 50 IU/mL; 25 IU/mL; 12,5 IU/mL; 6,25 IU/mL; 3,12 IU/mL. S0 có nồng độ 0 IU/mL.
2.1.3. Biotin-antibody: (Biotin gắn với kháng thể)
Pha theo tỉ lệ Biotin-kháng thể : Dung dịch hòa loãng Biotin-kháng thể là 1:100
2.1.4. Avidin-HRP:
Pha theo tỉ lệ Avidin-HRP : Dung dịch hòa loãng Avidin-HRP là 1:100
2.2. Tiến hành
- Tiến hành theo quy trình cài đặt trên máy tự động EVOLIS TWIN PLUS.
- Tổng thời gian làm xét nghiệm Lp-PLA2 khoảng 470 phút.
- Vẽ đường cong chuẩn trước, control đạt thì tiến hành đo mẫu
Các bước tiến hành như sau:
+ Hút 100 μl mỗi calibrator, control hoặc mẫu người bệnh vào các giếng
+ Ủ 120 phút ở 37o C
+ Loại bỏ chất lỏng, không rửa
+ Hút 100 μl dung dịch Biotin-kháng thể trực dụng vào mỗi giếng
+ Ủ 60 phút ở 37o C
+ Rửa các giếng 3 lần với 200 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa.
+ Hút 100 μl dung dịch Avidin-HRP trực dụng vào mỗi giếng
+ Ủ 60 phút ở 37o C.
+ Rửa các giếng 3 lần với 200 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa.
+ Hút 90 μl cơ chất TMB vào mỗi giếng
+ Ủ 10 - 30 phút ở 37o C.
+ Hút 50 μl dung dịch ngừng phản ứng vào mỗi giếng
+ Tiến hành đo trong vòng 30 phút
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Giá trị tham khảo:
Người lớn: 3,49 – 14,70 IU / mL
- Ý nghĩa lâm sàng: Lp – PLA2 tăng thì
+ Dự báo nguy cơ bệnh mạch vành và đột quỵ thường kết hợp với xơ vữa động mạch.
+ Có nguy cơ đột quỵ và nhồi máu cơ tim tăng gấp đôi
+ Cùng với huyết áp tâm thu cao nhất có nguy cơ đột quỵ tăng gấp 6 lần.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Có một số sai sót thường gặp:
- Lấy sai ống -> lấy lại
- Tuyệt đối không sử dụng máu vỡ hồng cầu, máu đục, máu vàng
- Mẫu máu ở người bệnh có dùng thuốc chống đông thì thời gian co cục máu lâu hơn trước khi ly tâm (hơn 30 phút)
- Mẫu có kết quả > 100 IU/mL thì phải hòa loãng mẫu với dung dịch hòa loãng.
- Những sai sót do máy thì hỏi kỹ sư để xử trí.
- Lưu ý Calibrator và QC bảo quản thật tốt để có đường cong chuẩn đạt yêu cầu.
Theo quyết định số: 320 /QĐ-BYT ngày 23 tháng 01 năm 2014