+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Hóa sinh - Miễn dịch (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-11.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-100.html)
+---- Chủ đề: Định lượng IMA bằng kỹ thuật ELISA (/thread-5944.html)
Định lượng IMA bằng kỹ thuật ELISA - tuyenlab - 04-17-2016
ĐỊNH LƯỢNG IMA (Ischemia Modified Albumin)
IMA là albumin bị biến đổi do thiếu máu cục bộ, được tạo ra khi albumin huyết thanh trong hệ tuần hoàn tiếp xúc với mô cơ tim bị thiếu máu cục bộ. IMA là một dấu ấn nhạy cho thiếu máu cục bộ cơ tim được các nhà nghiên cứu quan tâm. Các dấu ấn tim hiện có như Troponin và CK-MB thì nhạy với hoại tử cơ tim. Đó là dấu ấn của các tế bào cơ tim bị hoại tử trong nhồi máu cơ tim cấp. Tuy nhiên, phần lớn người bệnh với hội chứng mạch vành cấp có thiếu máu cục bộ cơ tim nhưng không bị nhồi máu.
I. NGUYÊN LÝ
Dùng kỹ thuật ELISA để định lượng IMA trong huyết thanh và huyết tương người.
Dựa vào tính đặc hiệu của kháng nguyên - kháng thể, theo phương pháp sandwich: các giếng được phủ kháng thể đặc hiệu cho IMA. Standard, mẫu và Biotin- kháng thể (đã chuẩn bị) được thêm vào, IMA trong mẫu kết hợp với kháng thể phủ trên giếng và Biotin-kháng thể mới được thêm vào. Sau khi rửa đi các Biotin-kháng thể không kết hợp, HRP- Avidin liên hợp (đã chuẩn bị) được thêm vào. Tiếp sau khi các giếng được rửa lần hai, cơ chất TMB được thêm vào giếng. Tiếp theo, dung dịch ngừng phản ứng thêm vào sẽ chuyển từ màu xanh sang vàng, đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ IMA trong mẫu thử, được đo ở bước sóng 450 nm.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Bác sĩ, cử nhân, kỹ thuật viên được đào tạo với máy Evolis Twin Plus.
2. Phương tiện, hóa chất
- Máy phân tích ELISA (có thể Evolis Twin Plus)
- Thuốc thử được cung cấp của hãng Cusabio (CSB-E09594giờ)
+ Đĩa phản ứng (96 giếng)
+ Biotin-kháng thể
+ Chuẩn (dạng đông khô)
+ Avidin-HRP
+ Dung dịch hòa loãng
+ Dung dịch rửa
+ Dung dịch hòa loãng Biotin-kháng thể
+ Cơ chất TMB
+ Dung dịch hòa loãng vidin-HRP
+ Dung dịch ngừng phản ứng.
Trong đó: HRP- vidin là vidin liên kết với HRP (Horseradish Peroxidase) TMB: 3,3’,5,5’ tetramethyl-benzidine
- Thuốc thử và dụng cụ cần nhưng không được cung cấp
+ Pipet chính xác
+ Các tube
+ Đầu côn pipet dùng một lần
+ Nước cất
+ Control 2 mức thấp và cao
3. Người bệnh
Không cần nhịn đói.
4. Phiếu xét nghiệm
Phiếu xét nghiệm theo mẫu bệnh viện và Bộ Y tế quy định, có ghi đầy đủ thông tin người bệnh.
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
- Sử dụng huyết thanh hoặc huyết tương chống đông bằng citrate, EDTA , heparin.
- Huyết thanh: sau khi lấy mẫu thì để 30 phút, co cục máu, sau đó ly tâm 3000 vòng/phút, trong10 phút. Tách ngay ra tube và bảo quản ở - 20oC. Ly tâm lại sau khi làm rã đông mỗi khi chạy mẫu. Chỉ rã đông một lần.
- Huyết tương: tương tự như trên nhưng phải ly tâm ngay sau khi lấy mẫu, không để quá 30 phút.
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Chuẩn bị thuốc thử
Đưa tất cả thuốc thử về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
2.1.1. Dung dịch rửa
Hòa 20 ml dung dịch rửa với nước cất để được dung dịch 500 ml.
2.1.2. Chuẩn (S0 - S7)
- Ly tâm lọ thuốc thử chuẩn (dạng đông khô) 6000 vòng/phút trong 30 giây.
- Thêm 1ml dung dịch hòa loãng vào lọ chuẩn (dạng đông khô) để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 200 IU/mL (S7), để ít nhất 15 phút, lắc đều.
- Hòa tiếp nhiều lần để được các dung dịch chuẩn trực dụng (S6 - S1) với các nồng độ lần lượt là 100 IU/mL; 50 IU/mL; 25 IU/mL; 12,5 IU/mL; 6,25 IU/mL; 3,13 IU/mL. S0 có nồng độ 0 pg/mL.
- Sử dụng trong 4 giờ và vứt ngay sau khi dùng.
2.1.3. Biotin-kháng thể
Pha theo tỉ lệ Biotin-kháng thể : Dung dịch hòa loãng Biotin-kháng thể là 1:100
2.1.4. Avidin-HRP
Pha theo tỉ lệ HRP-avidin : Dung dịch hòa loãng Avidin-HRP là 1:100
2.2. Tiến hành
- Tiến hành theo quy trình cài đặt trên máy tự động EVOLIS TWIN PLUS.
- Tổng thời gian hoàn thành xét nghiệm này khoảng 270 phút
- Vẽ đường cong chuẩn trước, control đạt thì tiến hành đo mẫu. Các bước tiến hành như sau:
+ Hút 100 μl mỗi calibrator, control hoặc mẫu người bệnh vào các giếng
+ Ủ 120 phút ở 37o C
+ Loại bỏ chất lỏng, không rửa
+ Hút 100 μl dung dịch Biotin-kháng thể trực dụng vào mỗi giếng
+ Ủ 60 phút ở 37o C
+ Rửa các giếng 3 lần với 200 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa
+ Hút 100 μl dung dịch vidin-HRP trực dụng vào mỗi giếng
+ Ủ 60 phút ở 37o C.
+ Rửa các giếng 3 lần với 200 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa
+ Hút 90 μl cơ chất TMB vào mỗi giếng
+ Ủ ở 37o C trong vòng 10 - 30 phút
+ Hút 50 μl dung dịch ngừng phản ứng vào mỗi giếng
+ Tiến hành đo trong vòng 30 phút
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Giá trị tham khảo:
Người lớn: 4,0 - 33,85 IU/mL
- Ý nghĩa lâm sàng: IM tăng trong
+ Hội chứng mạch vành cấp.
+ Tăng trong vòng vài phút sau khi thiếu máu cục bộ cơ tim, đạt đỉnh sau 6 giờ và tăng kéo dài đến 12 giờ.
+ Người bệnh xơ gan, vài loại nhiễm trùng và ung thư đang tiến triển
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Có một số sai sót thường gặp:
- Lấy sai ống -> lấy lại
- Tuyệt đối không sử dụng máu vỡ hồng cầu, máu đục, máu vàng
- Mẫu máu ở người bệnh có dùng thuốc chống đông thì thời gian co cục máu lâu hơn trước khi ly tâm (hơn 30 phút)
- Mẫu có kết quả vượt quá 200 IU/mL thì phải hòa loãng mẫu với dung dịch hòa loãng.
- Những sai sót do máy thì hỏi kỹ sư để xử trí.
- Lưu ý Calibrator và QC bảo quản thật tốt để có đường cong chuẩn đạt yêu cầu.
Theo quyết định số: 320 /QĐ-BYT ngày 23 tháng 01 năm 2014