+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Vi sinh Y học (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-71.html)
+---- Diễn đàn: Lý thuyết (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-97.html)
+---- Chủ đề: [LT] Các phương pháp chẩn đoán virus (/thread-589.html)
[LT] Các phương pháp chẩn đoán virus - tuyenlab - 06-25-2012
Để chẩn đoán được bệnh nhiễm virus, có thể dựa vào :
- Phát hiện sự có mặt của kháng thể (KT) kháng virus trong huyết thanh bệnh nhân ở thời điểm bắt đầu có triệu chứng hoặc sớm hơn (Chẩn đoán huyết thanh).
- Xác định sự hiện diện của virus hoặc sản phẩm của chúng trong máu bệnh nhân hoặc mô khác (Chẩn đoán trực tiếp hoặc phân lập virus).
1. Chẩn đoán huyết thanh:
Trong các phương pháp chẩn đoán huyết thanh thì kỹ thuật ELISA là thường được sử dụng nhất.
1.1. Kỹ thuật ELISA.
Nguyên lý: Đây là phản ứng miễn dịch đánh dấu, trong đó chất đánh dấu là một enzym dùng để phát hiện phức hợp kháng nguyên (KN) - kháng thể (KT) nhờ một cơ chất đặc hiệu.
Các kỹ thuật ELISA thường dùng:
- Kỹ thuật dùng kháng kháng thể IgM (KKT - IgM ) gắn enzym phát hiện KT:
1. Gắn KN lên nền cứng ( phiến dẻo hay đáy ống nghiệm )
2. Thêm huyết thanh cần xác định KT. Sau thời gian ủ, rửa để loại bỏ KT
không kết hợp với KN.
3. Thêm KKT - IgM gắn enzym, ủ một thời gian rồi rửa bỏ KKT- IgM thừa.
4. Thêm cơ chất. Sau thời gian ủ, cho chất ngưng phản ứng rồi đọc kết quả đo mật độ quang học OD (Opical density)
- Kỹ thuật "Sandwich" (Dùng KN gắn enzym để phát hiện KT) :
1. Gắn KN ( virus ) đã biết lên nền cứng.
2. Phủ huyết thanh cần xác định KT lên, để một thời gian rồi rửa nước.
3. Thêm KN gắn engym vào. Sau ủ, rửa để loại KN-enzym thừa.
4. Cho cơ chất đặc hiệu vào, sau thời gian ủ thì thêm chất ngưng phản ứng rồi đọc kết quả bằng đo mật độ quang học.
1.2. Các kỹ thuật khác
- Phản ứng kết hợp bổ thể (Complement fixation test) Trong phản ứng này có 2 hệ thống tham gia:
+ Hệ thống 1 gồm có KN và huyết thanh bệnh nhân cần tìm KT
+ Hệ thống 2: hồng cầu cừu (HCC) và huyết thanh kháng HC (KHC) cừu. Trong đó, trung gian giữa hai hệ thống này là bổ thể (BT): Nếu trong huyết
thanh bệnh nhân có KT thì KT sẽ kết hợp với KN, bổ thể sẽ gắn với phức hợp KN-KT. Vì bổ thể đã được chuẩn độ trước chỉ đủ để kết hợp với phức hợp KN- KT nên bổ thể không còn để kết hợp với phức hợp HCC- KHC của hệ thống 2 khi cho thêm vào, do vậy HC cừu không bị tan.
- Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (Haemagglutination - Inhibition ):
Do một số virus có cấu trúc bề mặt mang KN có khả năng làm ngưng kết HC. Do vậy dựa vào tính chất này ta chuẩn đoán được virus.
- Phản ứng trung hòa (Neutralization):
Do KT có thể làm mất khả năng gây nhiễm của virus đối với tế bào nuôi cấy hoặc động vật thí nghiệm. Vì vậy, dựa vào tính chất này người ta xác định được KT đặc hiệu trong huyết thanh. Tuy nhiên, kết quả này thực hiện khó khăn và cho kết quả chậm.
- Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (Immuno fluorescene) và miễn dịch phóng xạ (Radioimmuno assay).
Cả hai kỹ thuật này đều là kỹ thuật miễn dịch đánh dấu giống ELISA, nhưng chất đánh dấu dùng để xác định phức hợp KN-KT là huỳnh quang hoặc chất phóng xạ. Các kỹ thuật này thường ít được sử dụng.
2. Chẩn đoán trực tiếp
2.1. Nguyên lý
Sử dụng KT mẫu hoặc các thiết bị khoa học để xác định trực tiếp virus hoặc các thành phần hay chất chuyển hoá của chúng (acid nucleic hoặc protein)
2.2. Các kỹ thuật xác định nhanh
- Kỹ thuật ELISA: Về nguyên lý cũng giống như kỹ thuật tìm KT, nhưng mục đích ở đây là tìm KN.
- Miễn dịch huỳnh quang: Kỹ thuật này dùng chất màu huỳnh quang gắn vào KT để phát hiện KN của virus.
- PCR (Polymerase chain reaction): Đây là kỹ thuật khuyếch đại phân tử ADN và ARN có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Có thể phát hiện được acid nucleic (ADN hoặc ARN ) của virus sau khi được khuếch đại nhờ polymerase.
- Probes: Một số đoạn ADN của virus gắn chất phóng xạ thường được dùng để phát hiện genome hoặc mARN của virus trong mô hoặc dịch cơ thể bệnh nhân bằng sự lai phân tử.
- Kính hiển vi điện tử: Có thể phát hiện trực tiếp virus và hình thể của chúng. Tuy nhiên, ít sử dụng vì đòi hỏi bảo hộ và trang thiết bị hiện đại
- Tìm các thể vùi trong cơ thể: Một số virus có thể tạo ra các khối đặc biệt nằm trong nhân hoặc bào tương của tế bào nhiễm trùng (Ví dụ: Thể negri trong bệnh dại). Cho nên, có thể phát hiện các thể vùi này bằng thuốc nhuộm với các đặc điểm riêng của nó.
2.3. Phân lập và xác định virus
2.3.1. Các phương pháp lập virus
Sau khi lấy bệnh phẩm thì phải diệt hết tạp khuẩn bằng kháng sinh rồi mới nuôi cấy phân lập virus. Hiện nay, có 3 phương pháp thường dùng :
- Nuôi cấy phân lập trên tế bào cảm thụ:
+ Có 2 loại tế bào thường dùng để nuôi cấy phân lập virus, đó là: tế bào tiên phát (Ví dụ : tế bào thận khỉ) và tế bào thường trực (Ví dụ: tế bào Hela...).
+ Bệnh phẩm được gây nhiễm vào các tế bào nuôi cấy phải có đầy đủ chất dinh dưỡng như acid amin, muối khoáng và huyết thanh. Nhiệt độ thường là
370C và khí trường CO2 và O2 cũng phải luôn cân bằng.
+ Để phát hiện khả năng huỷ hoại tế bào của virus, ta có thể dựa vào các dấu hiệu là: nguyên sinh chất tế bào bị tiêu huỷ, do đó tế bào co tròn và không bám được vào thành chai. Ngoài ra, có thể virus tạo ra các ổ phá huỷ, môi trường trở thành màu đỏ tím.
- Nuôi cấy phân lập trên bào thai gà:
Thường dùng những quả trứng ấp được 8-11 ngày, soi lên đèn trong buồng tối để xác định buồng hơi và vị trí bào thai. Đục một lỗ ở buồng hơi rồi chọc kim tiêm qua, bơm khoảng 0,2mL bệnh phẩm vào vị trí đã xác định ( tuỳ theo từng virus). Cuối cùng, dùng farafin nóng chảy hàn kín lỗ thủng ở lại và tiếp tục cho ấp ở 35-360C với thời gian tuỳ từng loại virus.
- Phân lập virus trên động vật thí nghiệm:
Một số virus chỉ có thể phân lập bằng cấy truyền lên động vật thí nghiệm, thông thường nhất là chuột. Sau khi cấy truyền thì động vật thí nghiệm sẽ được quan sát các dấu hiệu của bệnh hoặc chết do virus gây ra.
2.3.2. Xác định virus:
Sau khi thu hoạch virus nuôi cấy phân lập được, chúng ta có thể xác định các virus này nhờ huyết thanh mẫu (Standard sera) bởi các phản ứng: ngăn ngưng kết hồng cầu, kết hợp bổ thể, trung hoà và miễn dịch huỳnh quang.
Tác giả: TS.BS. Trần Quang Cảnh - Khoa Xét nghiệm - HMTU