+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Vi sinh Y học (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-71.html)
+---- Diễn đàn: Lý thuyết (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-97.html)
+---- Chủ đề: [LT] Các phương pháp chẩn đoán vi khẩn (/thread-588.html)
[LT] Các phương pháp chẩn đoán vi khẩn - tuyenlab - 06-25-2012
Chẩn đoán vi sinh vật có ý nghĩa quyết định trong chẩn đoán các bệnh nhiễm khuẩn. Chẩn đoán vi sinh vật nhằm xác định căn nguyên vi khuẩn gây bệnh hoặc gián tiếp tìm kháng thể đặc hiệu do vi khuẩn kích thích cơ thể (đáp ứng miễn dịch của cơ thể). Vì vậy, chẩn đoán vi khuẩn hiện nay có thể bằng hai phương pháp: Chẩn đoán trực tiếp và chẩn đoán gián tiếp.
1. Chẩn đoán trực tiếp
1.1. Lấy bệnh phẩm
Bệnh phẩm được lấy là mô bệnh hoặc những chất bài tiết từ vị trí nhiễm trùng có chứa vi khuẩn gây bệnh lấy từ bệnh nhân. Vì vậy, bệnh phẩm được lấy tuỳ theo từng bệnh nhiễm trùng (có thể là phân ở bệnh nhân nhiễm khuẩn đường ruột, máu ở bệnh nhân trong nhiễm trùng huyết và dịch não tuỷ ở bệnh nhân viêm màng não). Để đảm bảo cho các xét nghiệm đạt độ tin cậy, quá trình lấy bệnh phẩm phải đảm bảo các nguyên tắc sau đây:
- Lấy đúng thời điểm: Đó là lúc vi khuẩn có ở bệnh phẩm nhiều nhất, ví dụ cấy máu tìm vi khuẩn thương hàn phải được thực hiện lúc bệnh nhân đang sốt cao.
- Đúng vị trí: Lấy ở nơi đang có biểu hiện bệnh lý, trong các mô bệnh (viêm nhiễm) thì nên lấy ở ranh giới giữa nơi lành và nơi tổn thương.
- Lấy đủ số lượng: Đảm bảo lấy được vi khuẩn gây bệnh và đủ số lượng bệnh phẩm để thực hiện các kỹ thuật xác định khác nhau.
- Phải vô khuẩn: Không để vi khuẩn từ bên ngoài nhiễm vào bệnh phẩm làm sai kết quả và không gây nhiễm khuẩn thêm cho bệnh nhân.
- Vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm đúng quy định: Sau khi bệnh phẩm lấy xong cho vào các dụng cụ vô khuẩn dán nhãn đề tên người bệnh, khoa, phòng điều trị, tên chất thử, thời gian lấy bệnh phẩm... đóng gói đúng quy cách rồi gửi về phòng xét nghiệm. Đa số bệnh phẩm cần được nuôi cấy nên phải giữ cho vi khuẩn còn sống đến lúc làm xét nghiệm. Muốn vậy thì bệnh phẩm phải được chuyển và làm xét nghiệm ngay. Nếu chưa có điều kiện phải giữ chúng trong môi trường vận chuyển hoặc dung dịch bảo quản ở nhiệt độ thích hợp.
1.2. Nhuộm soi (chẩn đoán nhanh)
Tùy theo từng chẩn đoán bệnh mà chọn phương pháp nhuộm soi thích hợp. Đa số vi khuẩn nhuộm bằng phương pháp Gram, một số nhuộm bằng phương pháp đặc biệt như Ziehl – Neelsen, Fotana – Tribondeau… Hầu hết mục đích của nhuộm bệnh phẩm, cụ thể là nhuộm Gram thường để quan sát hình thể, kích thước, cách sắp xếp và tính chất bắt màu của vi khuẩn; cũng như đánh giá các loại tế bào và mối quan hệ giữa vi khuẩn và tế bào như vi khuẩn nằm trong hay ngoài tế bào, vi khuẩn nằm trên tế bào. Vì vậy, nhuộm soi trực tiếp từ bệnh phẩm chỉ mang tính chất gợi ý cho chẩn đoán. Tuy nhiên, trong một số trường hợp rất có ý nghĩa trong chẩn đoán và có thể xem như chẩn đoán xác định:
- Nhuộm Gram: trong một số bệnh như lậu sinh dục, viêm màng não do não mô cầu, phế cầu... qua nhuộm Gram có thể chẩn đoán sớm căn nguyên của các bệnh nhiễm trùng này.
- Nhuộm Ziehl – Neelsen: rất có ý nghĩa trong chẩn đoán các vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium, đặc biệt là trực khuẩn lao, phong...
- Nhuộm Fotana – Tribondeau: rất có ý nghĩa trong chẩn đoán các xoắn khuẩn như: giang mai, Leptospira...
Ngoài ra, phương pháp soi tươi cũng rất có ý nghĩa trong chẩn đoán vi khuẩn trong bệnh phẩm, như: phẩy khuẩn tả, xoắn khuẩn giang mai...
1.3. Nuôi cấy phân lập và xác định
1.3.1. Nuôi cấy phân lập
Nuôi cấy vi khuẩn trên các môi trường thích hợp nhằm tăng sinh vi khuẩn về số lượng và tách được những khuẩn lạc riêng để nhận dạng khuẩn lạc. Sau khi phân lập được vi khuẩn riêng rẽ, sẽ tiến hành xác định các tính chất sinh vật hóa học đặc trưng của nó. Trên thực tế, để nuôi cấy bệnh phẩm, người ta sử dụng các môi trường nuôi cấy khác nhau. Phần lớn dùng môi trường phân lập để nuôi cấy những bệnh phẩm bội nhiễm và với mục đích chọn lọc vi khuẩn (Ví dụ: nuôi cấy phân tìm phẩy khuẩn tả trên môi trường thạch kiềm hoặc TCBS: Thiosulfite
Citrate Bile salt Sucrose). Tuy nhiên, một số bệnh có thể do nhiều loại vi khuẩn gây ra thì phải sử môi trường có phổ nuôi cấy rộng, như thạch máu, chocolate (Ví dụ: dịch não tủy, dịch tỵ hầu luôn phải nuôi cấy vào một đĩa môi trường thạch máu và một đĩa môi trường chocolate). Khi cấy chuyển vùng cần lưu ý:
- Vùng nguyên thuỷ không nên cấy quá ít vì như vậy sẽ làm giảm tỉ lệ dương tính khi bệnh phẩm có ít vi khuẩn.
- Các vùng tiếp theo các đường cấy nên thật dày nhưng chỉ nên để vài đường cấy đầu tiên của vùng sau chạm vào vùng trước, như vậy sẽ có được những khuẩn lạc riêng rẽ.
1.3.2. Xác định vi khuẩn
- Nhuộm Gram: thông thường luôn nhuộm các khuẩn lạc nghi ngờ phân lập được
để xác định hình thể và tính chất bắt màu để gợi ý cho các chẩn đoán tiếp theo.
- Xác định các tính chất sinh vật hóa học: thực hiện các phản ứng sinh vật hóa học để chẩn đoán xác định vi khuẩn phân lập được.
- Định typ vi khuẩn:
+ Xác định tính chất sinh vật hoá học và định typ sinh học (Biotype): Dựa trên các đặc điểm sinh hóa đặc trưng, một số vi khuẩn có thể phân loại theo typ sinh học bằng tính chất sinh vật hoá học.
+ Xác định tính chất kháng nguyên (định typ huyết thanh - serotype): Dùng kháng thể đã biết trước (kháng huyết thanh mẫu) để xác định kháng nguyên (kháng nguyên lông, kháng nguyên thân, kháng nguyên vỏ...) của vi khuẩn phân lập được dựa vào phản ứng kết hợp kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu. Vì vậy xác định vi khuẩn bằng cách này có độ chính xác cao. Phương pháp này thường được áp dụng trong việc xác định vi khuẩn đường ruột bằng các phản ứng ngưng kết. Các phản ứng này xác định nhóm, typ của vi khuẩn dựa vào kháng huyết thanh.
- Xác định tính chất ly giải bởi phage (định typ ly giải- lysotype): Dùng phage đặc hiệu đã biết trước cho tiếp xúc với vi khuẩn nghi ngờ xác định vi khuẩn có bị ly giải bởi phage hay không. Phương pháp này có độ chính xác rất cao, áp dụng trong chẩn đoán dịch tễ song khó có chủng phage mẫu.
1.4. Chẩn đoán khả năng gây bệnh thực nghiệm:
Một số vi sinh vật gây bệnh cho người đồng thời cũng có khả năng gây bệnh cho súc vật nên có thể tiêm truyền cho súc vật để gây bệnh thực nghiệm. Các súc vật thường được tiêm truyền là thỏ, chuột lang, chuột bạch, chuột nhắt trắng. Đối với một số vi sinh vật có thể cần các súc vật lớn như dê, cừu, khỉ, bò… Đường tiêm truyền có thể tiêm trong da, dưới da, bắp, tĩnh mạch, phúc mạc, giác mạc… tuỳ theo khả năng gây bệnh của từng loại vi khuẩn. Các loại vi sinh vật khác nhau thì gây nên những bệnh cảnh khác nhau và có tính chất đặc trưng cho các loại súc vật nhất định. Sau khi tiêm truyền, theo dõi sự diễn biến của bệnh và tìm những tổn thương điển hình. Cuối cùng có thể mổ súc vật để đánh giá khả năng gây bệnh của vi khuẩn bằng đại thể.
1.5. Chẩn đoán tìm kháng nguyên hoặc các thành phần cấu trúc hoặc chất chuyển hóa của vi khuẩn trong bệnh phẩm
- Xác định kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn trong bệnh phẩm:
+ Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp phát hiện vi khuẩn tả trong bệnh phẩm phân.
+ Phản ứng ngưng kết hạt latex dùng trong chẩn đoán tìm kháng nguyên của vi khuẩn S. pneumoniae, N. meningitidis và H. influenzae trong dịch não tủy bệnh nhân viêm màng não mủ.
+ Phản ứng khuếch đại gen PCR để xác định ADN hoặc mARN đặc hiệu của vi khuẩn trong bệnh phẩm để chẩn đoán bệnh nhiễm trùng.
2. Chẩn đoán gián tiếp (Chẩn đoán huyết thanh)
2.1. Nguyên tắc
Chẩn đoán gián tiếp các bệnh nhiễm khuẩn là dựa vào kháng nguyên mẫu (được điều chế từ vi khuẩn gây bệnh) đã biết trước để phát hiện kháng thể đặc hiệu tương ứng bằng các phản ứng kết hợp kháng nguyên và kháng thể. Phản ứng dương tính khi có xuất hiện phức hợp kháng nguyên – kháng thể (tức là có mặt của kháng thể kháng lại vi khuẩn gây bệnh trong huyết thanh bệnh nhân).
2.2. Các bước tiến hành
2.2.1. Lấy bệnh phẩm:
Lấy máu tĩnh mạch, tuỳ theo từng phương pháp mà lấy số lượng máu thích hợp (thường lấy 3 - 5ml) cho vào ống nghiệm khô, để máu đông, ly tâm lấy huyết thanh và phá huỷ bổ thể ở 560C/ 30phút. Thông thường, nên lấy máu hai lần; trong lần thứ nhất vào những ngày đầu của bệnh (sau khi tách lấy huyết thanh thì giữ ở tủ lạnh – 20oC cho đến khi làm phản ứng), lần thứ hai sau lần thứ nhất 7 - 10 ngày để xác định động lực kháng thể.
2.2.2. Làm phản ứng huyết thanh:
Trong trường hợp, huyết thanh bệnh nhân được lấy hai lần để xác định động lực kháng thể thì phải tiến hành đồng thời trong cùng thời gian và cùng điều kiện phòng xét nghiệm.
- Huyết thanh bệnh nhân được pha loãng thành nhiều nồng độ khác nhau, thường giảm dần theo bậc 2.
- Hai mẫu huyết thanh I và II cùng được tiến hành làm phản ứng trong cùng một điều kiện (huyết thanh kép).
- Xác định hiệu giá kháng thể: Hiệu giá kháng thể được tính là nồng độ huyết thanh được pha loãng nhất mà ở đó phản ứng kết hợp kháng nguyên và kháng thể còn xẩy ra (+).
- Xác định động lực kháng thể: So sánh hiệu giá kháng thể của hai mẫu huyết thanh lần I và II để tìm động lực kháng thể. Động lực kháng thể là sự gia tăng hiệu giá kháng thể lần II so với lần I, ít nhất là gấp 2 lần. Khi có động lực kháng thể thì kết luận người bệnh bị nhiễm khuẩn.
Tác giả: TS.BS. Trần Quang Cảnh - Khoa Xét nghiệm - HMTU