+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Vi sinh Y học (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-71.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-98.html)
+---- Chủ đề: Neisseria gonorrhoeae Real-time PCR (/thread-5653.html)
Neisseria gonorrhoeae Real-time PCR - tuyenlab - 12-31-2015
Neisseria gonorrhoeae Real-time PCR
I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
1. Mục đích
Phát hiện DNA đặc trưng của Neisseria gonorrhoeae từ các vết loét hoặc dịch đường sinh dục của người
2. Nguyên lý
Phát hiện DNA đặc trưng của Neisseria gonorrhoeae dựa trên nguyên lý của kỹ thuật real-time PCR.
II. CHUẨN BỊ
1.Người thực hiện
- Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
2. Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
2.1. Trang thiết bị
- Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
- Bộ lưu điện
- Tủ an toàn sinh học cấp 2
- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml
- Máy ly tâm 25000 x g
- Máy ủ nhiệt
- Máy vortex
- Tủ lạnh 2oC -8oC
- Tủ âm sâu (- 20oC) hoặc (-70oC) (nếu có)
- Micropipettes các thể tích từ 5 ul - 1000 ul.
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Tăm bông vô trùng
Găng không có bột tal
Khay đựng bệnh phẩm
Hộp vận chuyển bệnh phẩm
Sinh phẩm chẩn đoán
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng
Kit tách DNA
Ngoại kiểm (nếu có)*
ống Falcol 50ml
Ependoff 1,7ml
Ependoff 0,2ml
Đầu côn 10 µl có lọc
Đầu côn 30 µl
Đầu côn 200 µl có lọc
Đầu côn 1 ml có lọc
Water-DEPC Treated
Giấy thấm
Giấy xét nghiệm
Sổ lưu kết quả xét nghiệm
Bút viết kính
Bút bi
Mũ
Khẩu trang
Găng tay xử lý dụng cụ
Quần áo bảo hộ
Dung dịch nước rửa tay
Cồn sát trùng tay nhanh
Dung dịch khử trùng
Khăn lau tay
* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm)..
3. Bệnh phẩm
Dịch niệu đạo, dịch âm đạo, nước tiểu, dịch vết loét
4. Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
1. Lấy bệnh phẩm
- Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (xem phụ lục 3)
- Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu (xem phụ lục 6).
2. Tiến hành kỹ thuật: Bộ sinh phẩm NGN rPCR Mix (VD)
2.1. Thu nhận và Xử lý mẫu
Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết DNA
2.2. Tách chiết DNA: Tách chiết bằng hóa chất phenol/chloroform
2.3. Thực hiện phản ứng real-time PCR
- Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
- Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cầnTrước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.
- Cho chứng +, chứng - hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube NGN rPCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.
- Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình real- time PCR.
- Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
- Chọn màu “FAM” và “HEX” và “CY5” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.
- Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động
- Lưu file dữ liệu vào máy tính
- Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1. Điều kiện của phản ứng
- Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM và màu HEX tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu CY5 dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền (đường biểu diễn âm tính).
- Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM và màu HEX âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu CY5 dương tính
2. Phân tích mẫu
- Mẫu dương tính: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng tương ứng với màu của từng tác nhân và bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trước. Một mẫu có thể dương tính với 1 trong 2 tác nhân hoặc dương tính đồng thời cả 2 tác nhân.
- Mẫu nghi ngờ: Mẫu có đường biểu diễn dương tính và bắt đầu từ sau chu kỳ 36 đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thực hiện lại xét nghiệm sau 1-3 tháng.
- Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính.
3. In đồ thị kết quả
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
1. Nguyên nhân: Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
2. Khắc phục
- Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.
- Trừ những mẫu sự cố, tất cả các mẫu bình thường đều có thể lấy kết quả.
Theo quyết định số 26 /QĐ-BYT ngày 03 tháng 01 năm 2013