+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Vi sinh Y học (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-71.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-98.html)
+---- Chủ đề: Neisseria gonorrhoeae PCR (/thread-5652.html)
Neisseria gonorrhoeae PCR - tuyenlab - 12-31-2015
Neisseria gonorrhoeae PCR
I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
1. Mục đích
Phát hiện sự có mặt bộ gen của Neisseria gonorrhoeae (vi khuẩn lậu) có trong bệnh phẩm.
2. Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý thuật PCR.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
2. Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
2.1. Trang thiết bị
- Tủ an toàn sinh học tối thiểu cấp 1
- Máy ủ nhiệt
- Máy ly tâm 25000 x g
- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml
- Máy vortex
- Máy chạy PCR
- Các loại pipet điều chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl
- Máy điện di
- Máy đọc ảnh gel
- Tủ lạnh thường
- Tủ âm sâu (-200C) hoặc (-700C) (nếu có)
- Bộ lưu điện
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Giấy xét nghiệm
Dụng cụ lấy bệnh phẩm
Găng không có bột (DNase-RNase free)
Ống nhựa Ependoff 1.5ml
Bút viết kính, bút bi, diêm
Xà phòng
Khăn lau tay
Bông, cồn
Nước muối sinh lý
Bộ KIT chiết tách DNA Đóng gói 50 phản ứng
Khấu hao sinh phẩm cho chứng và QC kiểm tra lại, standard các loại
PBS Buffer. Đóng gói 500ml
Absolute Ethanol. Đóng gói 1000ml
10mM dNTP mix. Đóng gói 100µl
Taq DNA Polymerase, Native
Đóng gói: 5 units/µl, 500 units (100 µl)
Primer đặc hiệu cho vi khuẩn Neisseria gonorrhoeae
Đóng gói 50nM
UltraPure DNase/RNase Distilled Water
Đóng gói 500ml
Ultrapure Agarose
Đóng gói 100g
Ultrapure TBE Buffer 10X
Đóng gói 1000ml
100bp DNA ladder
Đóng gói 50ug
10X BlueJuice Gel Loading dye
Đóng gói 3x1ml
Utrapure 10mg/ml Ethidium Bromide
Đóng gói 10ml
ống ly tâm 1,7ml
Đóng gói 500c/túi
ống PCR 0,2 ml, nắp phẳng
Đóng gói: 500c/túi, 1000c/hộp
Đầu côn 1000ml có lọc
Đầu côn 200ml có lọc
Đầu côn 0,2-10µl có lọc
Dung dịch khử trùng
Sổ lưu kết quả xét nghiệm
Khay đựng bệnh phẩm
Hộp lưu bệnh phẩm
Quần áo bảo hộ
Mũ
Khẩu trang
Găng tay xử lý dụng cụ
Giấy thấm
EQAS (nếu thực hiện)*
* Ghi chú:
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
3. Bệnh phẩm: Các loại dịch tiết và mô sinh thiết
4. Phiếu xét nghiệm: Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
1. Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 3).
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Tách chiết DNA từ bệnh phẩm
2.2. Pha hỗn hợp phản ứng PCR
2.3. Chạy phản ứng PCR
2.4. Điện di sản phẩm PCR
2.5. Đọc kết quả
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Phản ứng dương tính: có vạch sản phẩm PCR tương ứng với cặp mồi.
- Phản ứng âm tính: không có vạch sản phẩm PCR tương ứng với cặp mồi.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
1. Sai sót
- Phản ứng dương tính giả: do tạp nhiễm từ môi trường
- Phản ứng âm tính giả: do phản ứng PCR bị ức chế
2. Xử trí
Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân thủ chặt chẽ quy trình kỹ thuật
Theo quyết định số 26 /QĐ-BYT ngày 03 tháng 01 năm 2013