+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Vi sinh Y học (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-71.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-98.html)
+---- Chủ đề: Vibrio cholerae giải trình tự gene (/thread-5649.html)
Vibrio cholerae giải trình tự gene - tuyenlab - 12-30-2015
Vibrio cholerae giải trình tự gene
I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
1. Mục đích
Xác định chính xác Vibrio cholera
2. Nguyên lý
Bằng kỹ thuật giải trình tự nucleotide dựa trên trình tự gen 16S RNA
ribosome của vi khuẩn.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
2. Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
2.1. Trang thiết bị
- Tủ an toàn Sinh học cấp 2
- Máy PCR
- Máy đọc điện di
- Máy giải trình tự gen
- Máy ly tâm 25000 x g
- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml
- Máy ủ nhiệt
- Máy vortex
- Micropipette
- Bộ lưu điện
4.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
- Bông
- Cồn
- Bơm kim tiêm
- Panh
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm
- Găng không có bột (DNase-RNase free)
- Sinh phẩm chẩn đoán
- Khấu hao sinh phẩm cho kiểm tra lại
- Kit tách chiết DNA
- DNA marker
- Primer 1
- Primer 2
- Ống Eppendorf 1,5 ml
- Ống Eppendorf 0,2 ml
- Đầu côn 10 µl có lọc
- Đầu côn 30 µl
- Đầu côn 200 µl có lọc
- Đầu côn 1 ml có lọc
- Ethanol BDH
- Water-DEPC Treated
- Giấy thấm
- Giấy xét nghiệm
- Sổ lưu kết quả xét nghiệm
- Bút viết kính
- Bút bi
- Mũ
- Khẩu trang
- Găng tay
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bảo hộ
- Dung dịch nước rửa tay
- Cồn sát trùng tay nhanh
- Dung dịch khử trùng
- Khăn lau tay
- EQAS (nếu thực hiện)*
* Ghi chú:
- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
3. Bệnh phẩm
Bệnh phẩm phân hoặc chủng Vibrio cholera nuôi cấy thuần.
4. Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
1. Lấy bệnh phẩm
Bệnh phẩm phân có thể lấy qua bô, lấy bằng tăm bông trực tràng. Đặc điểm phân thường trắng như nước vo gạo, không màu, không mùi, rất hiếm khi có nhày, máu.
Dụng cụ lấy phân phải có nắp xoáy, tốt nhất là 2 lớp, bên ngoài có thêm một lớp bảo vệ để tránh lây nhiễm. Bệnh phẩm sau khi lấy phải gửi ngay đến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt, nếu quá 2 tiếng phải bảo quản trong môi trường Cary – Blair.
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Tách chiết DNA tổng số
2.2. Thực hiện PCR gen 16S ARN ribosome
2.3. Điện di kiểm tra sản phẩm
2.4. Giải trình tự gen
2.5. iểm tra độ tương đồng DNA
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Sản phẩm PCR phải có một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét và không bị đứt gẫy. Trình tự DNA của gen đích phải có độ tương đồng ≥ 95 % mới có thể kết luận được loài.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Trong trường hợp không có sản phẩm PCR, cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết DNA tổng số, chất lượng primers và master mix, và thực hiện lại xét nghiệm.
- Nếu trình tự DNA bị nhiễu cần phải kiểm tra lại độ đặc hiệu của sản phẩm PCR hoặc quá trình chạy PCR sequencing bị nhiễm chéo.
Theo quyết định số 26 /QĐ-BYT ngày 03 tháng 01 năm 2013