+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Vi sinh Y học (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-71.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-98.html)
+---- Chủ đề: Mycobacterium tuberculosis RFLP typing (/thread-5635.html)
Mycobacterium tuberculosis RFLP typing - tuyenlab - 12-22-2015
Mycobacterium tuberculosis RFLP typing
I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
1. Mục đích
Phân nhóm di truyền các chủng M. tuberculosis.
2. Nguyên lý
Kỹ thuật phân nhóm vi khuẩn M. tuberulosis - Restriction fragement length polymophism (RFLP) dựa trên phương pháp lai phân tử với mẫu dò đặc hiệu với DNA của vi khuẩn lao được cố định trên màng lai. Tính đa hình về kích thước tạo ra do sự khác biệt về số lượng bản sao và vị trí của các đoạn IS6110 trên nhiễm sắc thể vi khuẩn cho phép phân loai M.tuberculosis thành các nhóm nhỏ.
Trên nhiễm sắc thể Mycobacterium tuberculosis có các đoạn IS6110. Trên đoạn IS6110 có các vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn, đồng thời ngoài đoạn IS6110 cũng có các vị trí cắt giới hạn tương ứng. Sử dụng enzyme cắt giới hạn chia bộ gene vi khuẩn thành nhiều đoạn có kích thước khác nhau. Số lượng bản sao IS6110 khác nhau cho ta số đoạn cắt khác nhau. Điện di, chuyển DNA lên màng lai, lai với mẫu dò đặc hiệu để phát hiện số lượng và kích thước các đoạn cắt.
![[Image: HOWHP1uNqeoDY9qn8g9y1C3dsqQy8nfVDbIUDAfj...56-h431-no]](https://lh3.googleusercontent.com/HOWHP1uNqeoDY9qn8g9y1C3dsqQy8nfVDbIUDAfjQGQcqE4NOrc5Xa8aGfyURd9zDg_MVKjnkn25PvAd1BFAKufVB1ozMmTVbuKuNdHBg_Fv0DcB-SfJ3sFBtFg04kTrW40nhYkue4-iAqI7TCp5YeaUIatVSw6LyTBPw9JD3YwSHm8Wb5YbavC3E9aL8VvGt8QDF9qESgHDnpCi2Dgc7vcPsHxqsHC2247OaLhkSGzuQsLzI4qz9SkC-2Ou-7HwoP0jYAPpSFCDOvveMfgq9TxXS6sUKK7jGJpelMnykQ3G_Anien9tmBILGYEF2GgPIef6pjQYD1KGNFddL6veIzK3w-_WEsyUZw-0rz4T3otb9t9YxwDoGFRYe5sd9u3Ms89_4OEGyybxrX29MHmMejbwgddIfSFB26GWFop9lStErqI5rWwfWWE5wyGdWHu5M38EEVLFqI_YftKlUU3XgnyRgVPZU2fr9MoRVVymu48FQ21yLzFNwTDj8P9IGqFhJ9KwfHrKg5KtWTo-W-nG7h5_u-kdwoAbSyjTd9KIkCnuf5WnnmxtIj44rLH-rJwSFV0k=w656-h431-no)
Hinh 1. Vị trí đoạn IS 6110 và enzyme cắt giới hạn PvuII
II. CHUẨN BỊ
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
1. Người thực hiện
- Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
2. Phương tiện, hóa chất
2.1. Trang thiết bị
- Tủ ATSH cấp II
- Cân điện tử
- Máy siêu ly tâm tuýp 1.5ml
- Pipette tự động 10, 200, 1000µl.
- Máy ly tâm mini (Spin down)
- Panh, kẹp (Forceps
- Máy ủ nhiệt khô/ướt
- Tủ sấy
- Máy siêu âm (Ultrasonic)
- Nồi hấp khử trùng
- Máy nhân gene
- Tủ thao tác PCR
- Lò vi sóng (Microwave Oven)
- Đồng hồ hẹn giờ
- Bộ điện di
- Hộp giữ lạnh
- Máy vortex
- Lò lai DNA
- Máy lắc ngang
- Hộp ủ phim X-ray
- Tủ lạnh 4o /- 20o/-80o
- Hộp rửa phim
- Hệ thống chụp ảnh điện di Pringraph
- Hệ thống UV Stralinker
- Hệ thống Vacuum Blotter
- Hệ thống Gel Documentation
- Máy đo nồng độ DNA Smart Spec™ Plus
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
- Protein K
- SDS
- TE buffer
- Lysozym
- Chloroform
- Alcohol
- Isopropanol
- Ethanol
- CTAB
- NaCL
- Sodium acetat
- TAE buffer
- Hybridization buffer solution
- SSC buffer stock solution 20 X
- ECL Direct Nucleic Acid Labelling System
- ECL Detection Reagents
- Hot start TagDNA polymerase
- 100 bp DNA ladder
- (CGG)5 primer
- LightCycler FastStart DNA MasterplusHybprobe
- Pvu II
- Alu I
- Primer INS 1, 2
- SeaKem Gold agarose
- Agarose
- Ethidium Bromid
- Streptavidin - POD- Conjugate
- Standard chemical for pH metter
- Nước tinh sạch ( pha PCR Mix )
- Nước cất hai lần ( pha buffer )
- Đầu côn 10 µl
- Đầu côn 100 µl
- Đầu côn 1000 µl
- Eppendorf 0,2 ml
- Eppendorf 1,5 ml
- Cryotube 1.5 ml
- Giấy tráng kim
- Capillary(20mcl)
- Màng hybbond
- Plastic Wrap
- Găng tay
- Khẩu trang N95
- Khăn giấy
- Cồn 70°
- Bút MARKER
3. Bệnh phẩm
Thực hiện xét nghiệm phân nhóm M. tuberculosis cho các bệnh phẩm là chủng vi khuẩn lao mọc trên môi trường đặc.
4. Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở
trên.
1. Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 2)
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Lập danh sách, cập nhập thông tin mẫu cần xét nghiệm.
2.2. Xử lý mẫu theo danh sách đã trích lọc
2.3. Tách chiết DNA vi khuẩn theo quy trình chuẩn
2.4. Chuẩn bị thang DNA và mẫu dò IS6110
2.5. Thực hiện phản ứng cắt bằng Enzyme cắt giới hạn
2.6 .Ước lượng/đo nồng độ DNA sau phản ứng cắt
2.7 .Điện di DNA
2.8. Xử lý gel sau khi điện di
2.9. Chuyển DNA lên màng lai
2.10. Lai với ECL kít
2.11. .Rửa màng sau khi lai
2.12. Phát hiện tín hiệu lai bằng ECL
2.13. Đọc và phân tích kết quả
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Tín hiệu lai được thể hiện bằng những vach màu đen trên phim. Scan các phim này vào máy tính và phân tích bằng chương trình Bionumerics. Sau khi chuẩn hóa các phim, dựa trên hình ảnh các băng vạch, các mẫu chủng sẽ được so sánh với nhau và so với mẫu chuẩn để phân nhóm chủng M. tuberculosis.
Trong một số trường hợp khó nhận biết các băng vạch với nhau nên đôi khi kết quả không đồng nhất, cần lặp lại xét nghiệm để xác định kết quả.
![[Image: ibCpR5b8jnclora8d6rnnm42i3uBfsKXQR9Joei2...96-h532-no]](https://lh3.googleusercontent.com/ibCpR5b8jnclora8d6rnnm42i3uBfsKXQR9Joei2oPLPUL5YP3qNTPlnAfaZ-EDEr8ONytNfNZYsnP0gqFskbqCwDvoCo_cxA4FTjECoWYdra5IpS3zrUTd8H8nFoejsriyKmhS5IF6KqDUWtKAS9L3k_fT-yV6aTxvNNRHV3DMMJyYaY4DX4vzKUdS3DWVAMrw3iuU8gDiNKqWQuoPACa2HOCB80ozAtNqmZcSohH0u23O0gnLyw_KPNzDCl7FH0wfGdFjqv-fsJF--Sv3dEXltw5PI4SeLDSAuNNcuFWyZshV6gE6dGsVhn_deKsE8HOrnadhxDwEV6JKe-zF_2wdTWtF78uxjs08zjWAi2vgv1Q7CG6ul8c662xcGEVqF9lllzLDPNdg0h5zhQP8QKQjeHsNdhxUnlLg0tEcIV8nnJw1smnBoTmiJT6G1Sjk0wloRLd6OTXH_kdPPiTIg0L49PbsO-8annwp2BzGRJ0N0JKHHI0Kt0r15CDBb0Czwx4VAsRJS7KO5l6aLuqaAnRQd3B9bjN03po7nQTnx1ZysGflwdxew5zUmwTZkUK1fTLTw=w596-h532-no)
Hinh 2. Kết quả RFLP được phân tích bằng Bionumerics
Theo quyết định số 26 /QĐ-BYT ngày 03 tháng 01 năm 2013