Diễn đàn xét nghiệm đa khoa
Mycobacterium tuberculosis Spoligotyping - Phiên bản có thể in

+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Vi sinh Y học (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-71.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-98.html)
+---- Chủ đề: Mycobacterium tuberculosis Spoligotyping (/thread-5634.html)

Mycobacterium tuberculosis Spoligotyping - tuyenlab - 12-22-2015

Mycobacterium tuberculosis Spoligotyping


I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Phân nhóm di truyền các chủng M. tuberculosis.

2. Nguyên lý

Phương pháp Spoligotyping (Spacer Oligonucleotide Typing) dựa trên nguyên tắc của phương pháp lai phân tử Southern blot. Các trình tự chuyên biệt trên các chủng Mycobacterium tuberculosis được nhân gene (PCR) và lai với các đoạn nucleotide đặc hiệu.

Trên DNA của các chủng M. tuberculosis có một trình tự bảo tồn đặc biệt chỉ có ở các chủng này được gọi là Direct Repeat (DR), kích thước khoảng 36bp. Giữa các DR này là các spacer kích thước khoảng 35bp đến 41 bp. Có 43 spacer được xác định ở M. tuberculosis. Sự có mặt hoặc thiếu hụt các trình tự này được xác định bằng lai ghép sản phẩm PCR với 43 oligonucleotide tổng hợp từ các trình tự đệm của M. tuberculosis H37Rv. Spoligotyping có thể phân biệt được các chủng thuộc nhóm M. tuberculosis dựa trên sự mất hoặc hiện diện các DR được phân tích , so sánh với dữ liệu spoligotyping quốc tế SpolDB4.

Khả năng mất các đoạn DR có thể xảy ra nhiều lần, độc lập ở các chủng, dẫn đến sự tiến hóa, xuất hiện các nhóm spoligotype khác nhau.
[Image: THKlCLnLqH8NAyE7qwQUbiZjygnakYEUwk-SZjeJ...86-h451-no]
Hinh 1. Các vùng DR trên bộ gene M. tuberculosis

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện
- Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

2. Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

2.1. Trang thiết bị

- Tủ ATSH cấp II

- Cân điện tử

- Máy siêu ly tâm tuýp 1.5ml

- Máy ly tâm mini (Spin down)

- Pipette tự động loại 10, 200, 1000µl.

- Panh, kẹp (Forceps

- Máy ủ nhiệt khô/ướt

- Tủ sấy

- Máy siêu âm (Ultrasonic)

- Nồi hấp khử trùng

- Máy nhân gene

- Tủ thao tác PCR

- Lò vi sóng (Microwave Oven)

- Đồng hồ hẹn giờ

- Bộ điện di

- Hộp giữ lạnh

- Máy vortex

- Lò lai DNA

- Máy lắc ngang

- Hộp ủ phim X-ray
- Tủ lạnh 4o /- 20o/-80o

- Hộp rửa phim

- Máy đọc gel

- Hệ thống buồng tối tráng phim

- Miniblotter

- Hệ thống máy tính

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

- PuReTag PCR Beads

- Dra gắn Biotinylabed 5”

- Drb

- Thạch điện di

- TAE x50

- Ethidium Bromid

- Streptavidin - POD- Conjugate

- ECL Detection Reagents ( 1 + 2 )

- Amersham Hyperfilm ECL ( 18 * 24 cm )

- Miếng đệm

- SDS

- Na2HPO4 * 2H2O

- EDTA

- NaCl

- NaOH

- Tris-HCl

- Boric Acid

- Deverlop Film

- Nước tinh sạch ( pha PCR Mix )

- Nước cất hai lần ( pha buffer )

- Vật tư tiêu hao

- Đầu côn 10 µl

- Đầu côn 100 µl

- Đầu côn 1000 µl

- Eppendorf 0,2 ml

- Eppendorf 1,5 ml

- Găng tay

- Khẩu trang N95

- Khăn giấy

- Cồn 70°

- Bút MARKER

- Bút chì kim 2B

- QC (nếu thực hiện) *

EQAS (nếu thực hiện) *

* Ghi chú:

- Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).

- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

Thực hiện xét nghiệm phân nhóm M. tuberculosis cho các bệnh phẩm là chủng vi khuẩn lao mọc trên môi trường đặc hoặc lỏng.

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

1. Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Lập danh sách, cập nhập thông tin mẫu cần xét nghiệm.

2.2. Xử lý mẫu theo danh sách đã trích lọc

2.3. Tách chiết DNA vi khuẩn theo quy trình chuẩn

2.4. Thực hiện phản ứng nhân gene

2.5. Lai sản phẩm PCR với màng lai Biodyne C

2.6. Phát hiện tín hiệu lai

2.7. Xử lý và phân tích kết quả

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Tín hiệu lai được thể hiện bằng những ô màu đen. Mỗi chấm đen tương ứng với một đoạn đệm. Phim được đọc từ trái sang phải và từ trên xuống dưới. Hai chủng đầu tiên được sử dụng làm mẫu chứng dương là H37Rv và P3. Một mẫu chứng âm là nước cất giúp kiểm soát các trường hợp dương tính giả, đồng thời kiểm tra sự nhiễm chéo giữa các rãnh lai DNA
[Image: lIE9pOsKAct-vBqDwmYd9SCUjWZtm_O5qh5rOrvb...07-h185-no]
Hinh 2. Kết quả Spoligotyping

Các tín hiệu lai được nhập vào máy tính và xử lý trên phần mềm Bionumeric. Chủng Beijing có kết quả từ vị trí 1-34 là nốt trắng, vị trí số 35 đến 43 là các nốt đen. Các chủng khác cũng sẽ được xác định và nhóm theo từng phân nhóm.

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
[Image: o7quK0aslUSi3xsrX06uuaglYbnPjiehufgQM5RD...31-h643-no]

Theo quyết định số 26 /QĐ-BYT ngày 03 tháng 01 năm 2013