+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Vi sinh Y học (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-71.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-98.html)
+---- Chủ đề: Định danh vi khuẩn bằng PRC (/thread-5612.html)
Định danh vi khuẩn bằng PRC - tuyenlab - 12-15-2015
Vi khuẩn định danh PCR
I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
1. Mục đích
Chẩn đoán nhanh vi khuẩn trực tiếp từ bệnh phẩm.
2. Nguyên lý
Xác định sự có mặt của gene đặc trưng cho vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
2. Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
2.1. Trang thiết bị
- Tủ an toàn Sinh học cấp 2
- Máy PCR
- Máy điện di
- Máy đọc điện di
- Máy ly tâm 25000 x g
- Máy ủ nhiệt
- Máy vortex
- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml
- Micropipette
- Tủ âm sâu (-20oC)
- Bộ lưu điện.
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
- Bông
- Cồn
- Bơm kim tiêm
- Panh
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm
- Găng không có bột (DNase-RNase free)
- Sinh phẩm chẩn đoán
- Khấu hao sinh phẩm cho kiểm tra lại
- Kit tách chiết DNA
- DNA marker
- Primer 1
- Primer 2
- Ependoff 1,7ml
- Ependoff 0,2ml
- Đầu côn 10 µl có lọc
- Đầu côn 30 µl
- Đầu côn 200 µl có lọc
- Đầu côn 1 ml có lọc
- Ethanol BDH
- Water-DEPC Treated
- Giấy thấm
- Giấy xét nghiệm
- Sổ lưu kết quả xét nghiệm
- Bút viết kính
- Bút bi
- Mũ
- Khẩu trang
- Găng tay
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bảo hộ
- Dung dịch nước rửa tay
- Cồn sát trùng tay nhanh
- Dung dịch khử trùng
- Khăn lau tay
- QC (nếu thực hiện) *
- EQAS (nếu thực hiện) *
* Ghi chú:
- Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
3. Bệnh phẩm
Vi khuẩn thuần và bệnh phẩm phân lập
4. Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
1. Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.
2. Tiến hành kỹ thuật
- Tách chiết DNA tổng số
- Thực hiện PCR
- Điện di kiểm tra sản phẩm
- Đánh giá và kết luận
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Sản phẩm PCR phải có một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét, không bị đứt gẫy và có kích thước tương ứng với đoạn gene đích cần khuếch đại.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Khi kết quả khi chứng âm và/hoặc chứng dương không hợp lý, cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết DNA tổng số, chất lượng primers và master mix, sau đó thực hiện lại xét nghiệm.
Theo quyết định số 26 /QĐ-BYT ngày 03 tháng 01 năm 2013