+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Giải phẫu bệnh (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-73.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-110.html)
+---- Chủ đề: Xác định đột biến gen EGFR bằng giải trình tự chuỗi DNA trên khối Parafin (/thread-5569.html)
Xác định đột biến gen EGFR bằng giải trình tự chuỗi DNA trên khối Parafin - tuyenlab - 12-04-2015
XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN EGFR BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA TRÊN KHỐI PARAFIN
I. NGUYÊN LÝ
Sử dụng máy giải trình tự gen để xác định các đột biến gen.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Bác sĩ giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học.
- Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học.
- Cử nhân sinh học (không bắt buộc).
2. Phương tiện, hóa chất
2.1. Phương tiện
+ Máy giải trình tự ABI 3130
+ Máy PCR
+ Máy điện di
+ Máy ly tâm lạnh
+ Lò vi sóng
+ Máy soi gel và chụp ảnh tự động
+ Máy cắt lát mỏng
+ Lưỡi dao cắt lát mỏng
+ Tủ ấm 37o và 56o
+ Tủ lạnh sâu
+ Ống hút
2.2. Hóa chất
+ Các hóa chất để thực hiện PCR
+ Hóa chất để điện di sản phẩm
+ Hóa chất tinh sạch sản phẩm PCR
+ Hóa chất để đọc giải trình tự gen
+ Dung dịch đệm lysis
+ Dung dịch K
+ Dung dịch phenol
+ Dung dịch clorofom
+ Etanol
+ Dung dịch acetat
+ dung dịch hòa tan DNA
+ Xylen
+ Dung dịch rửa
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
- Các khối parafin chứa bệnh phẩm được cắt lát mỏng và dán lên phiến kính
- Vùng mô ung thư được đánh dấu trên phiến kính
- Cạo mô ung thư vào ống ly tâm 1,5 ml
- Cho xylen vào ống ly tâm 2 lần để khử parafin
- Rửa lại bằng etanol và để khô trước khi ủ với proteinaza K ở 48oC trong 16 giờ
- Tinh sạch sản phẩm DNA
- Kết tủa DNA bằng etanol tuyệt đối
- Tách DNA bằng kit KAPA
- Khuyếch đại exon bằng PCR Master Mix của KAPA
- Chạy điện di trên thạch Agarose 1%
- Tinh sạch sản phẩm PCR bằng nitrogen kit
- PCR sản phẩm đã tinh sạch với BigDye kit
- Tinh sạch sản phẩm BigDye bằng Zymmo kit
- Giải trình tự gen bằng máy ABI 3130
- Phân tích kết quả giải trình tự bằng phần mềm có sẵn
IV. ĐỌC KẾT QUẢ
Kết quả được phân tích bằng phần mềm tương thích. Kết quả được đối chiếu với trình tự nucleotit trên DNA bình thường trong hệ thống dữ liệu ngân hàng gen để xác định chính xác nucleotit đột biến.
V. MỘT SỐ VẤN ĐỀ THƯỜNG GẶP, NGUYÊN NHÂN, CÁCH KHẮC PHỤC
- Không có đỉnh hoặc đỉnh hiển thị ở mức độ yếu:
+ Do không cho khuôn DNA hoặc khuôn cho vào ở dưới nồng độ cần thiết.
+ Không bổ sung mồi vào phản ứng khi GTT.
+ Mồi không tương tác hiệu quả với khuôn sử dụng: nếu GTT từ một plasmid nhân dòng:
Cần đảm bảo plasmid được tinh sạch hoàn toàn.
Cần xem lại trình tự mồi thiết kế nhằm bắt cặp đặc hiệu với khuôn. Plasmid nhân dòng có thể bị đứt gãy hoặc đoạn nhân dòng chỉ được chèn một phần vào plasmid, nên không có vị trí cho mồi bám vào.
Khuôn sử dụng cho GTT điện di thu được băng đúng kích thước quan tâm, nhưng thực chất là khuyếch đại một đoạn trình tự khác hoàn toàn với trình tự quan tâm (Ví dụ: một số gen có trình tự trùng khớp nhau một vài phần nhất định).
- Xuất hiện nhiễu: Do quá trình tinh sạch không loại bỏ hoàn toàn cồn hoặc sản phẩm PCR không đặc hiệu, do DNA bị thoái hóa bởi các chất ức chế nhiễm vào mẫu trong quá trình GTT như muối, phenol, EDTA…
- Đoạn đầu bị nhiễu, sau đó GTT được đoạn sau, nhưng tín hiệu thấp: có thể do mồi tự bắt cặp hoặc có sự tham gia của một mồi khác khi thao tác. Cần thiết kế lại mồi để loại bỏ trường hợp tự ghép cặp, đồng thời, tinh sạch sản phẩm PCR để loại bỏ hoàn toàn các chất cũng như mồi khác không cần thiết.
- Nhiều đỉnh chồng lên nhau: do mồi có nhiều vị trí bắt cặp, tinh sạch kém hoặc mẫu bị lẫn các DNA khác. Cần sử dụng mồi khác, đảm bảo loại bỏ hoàn toàn mồi và dNTPs. Nếu đoạn GTT được đưa vào plasmid nhân dòng, cần đảm bảo kiểm tra được khuẩn lạc duy nhất.
- Xuất hiện các đỉnh lạ sau GTT: trong mao quản có bong bóng chưa được loại bỏ hoàn toàn, mẫu bị nhiễm một thành phần nào đó, POP sử dụng trong GTT bị thoái hóa, hỏng.
Theo Quyết định Số: 5199 /QĐ-BYT