+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Giải phẫu bệnh (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-73.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-110.html)
+---- Chủ đề: Nhuộm Orcein phát hiện kháng nguyên HBsAg trong mô gan (/thread-5544.html)
Nhuộm Orcein phát hiện kháng nguyên HBsAg trong mô gan - tuyenlab - 11-30-2015
NHUỘM ORCEIN PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN HBsAg
TRONG MÔ GAN
TRONG MÔ GAN
I. NGUYÊN LÝ
Thông thường, virut có kích thước rất nhỏ và chỉ có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. Virut chỉ được coi là vật ký sinh khi chúng sinh sản (được nhân lên) trong tế bào vật chủ. Các tiểu phần virut nằm bên trong tế bào vật chủ được gọi là “thể vùi virut” và có thể thấy bằng kính hiển vi quang học. HBsAg (kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B) thường xuất hiện dưới dạng thể vùi trong bào tương tế bào gan. Bào tương của tế bào Küpffer cũng có thể có kháng nguyên này.
Phẩm nhuộm orcein và andehit – fuscin có khả năng nhuộm cầu nối disunfit có trong thành phần xistin của HBsAg và tạo ra hình ảnh “thủy tinh mờ” của tế bào gan bị nhiễm virut.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02
2. Phương tiện, hóa chất
2.1. Phương tiện, hóa chất chung
- Dung dịch cố định bệnh phẩm.
- Cồn (70o, 80o, 95o , 100o).
- Xylen hay toluen.
- Nước cất 2 lần.
- Parafin.
- Sáp ong.
- Albumin + glyxerin.
- Máy đo độ pH điện tử.
- Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
- Máy đúc khối parafin.
- Bàn hơ dùng điện.
- Máy cắt lát mỏng (microtome).
- Lưỡi dao cắt lát mỏng.
- Lò nấu parafin.
- Tủ ấm 37o và 56o.
- Tủ lạnh.
- Điều hòa nhiệt độ.
- Tủ hốt phòng thí nghiệm.
- Nguồn cấp nước chảy.
- Bể nhuộm bằng thủy tinh.
- Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.
- Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.
- Khuôn nhựa.
- Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
- Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
- Kẹp không mấu, kéo.
- Cân phân tích.
- Giấy lọc.
- Phiến kính, lá kính.
- Axit picric ngâm, làm sạch phiến kính.
- Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.
- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
- Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
2.2. Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây): Permanganat kali, axit sunfuric đậm đặc, axit oxalic, Orcein, axit periodic, HCl.
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Cố định
Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 -30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
2. Chuyển bệnh phẩm
3. Vùi parafin
4. Đúc khối parafin
5. Cắt và dán mảnh cắt
6. Nhuộm mảnh cắt
6.1. Chuẩn bị phẩm nhuộm
a. Dung dịch permanganat kali được axit hóa:
- Permanganat kali: 0,3 g
- Nước cất 100ml
- Axit sunfuric đậm đặc 0,3ml
b. Dung dịch axit oxalic 1,5%
c. Pha Orcein
- Hòa tan 1,0g orcein tổng hợp bằng cách đổ dần dần từng ít cồn 70 độ trong khi đang đun nóng nhẹ, cách thủy, vào khoảng 56ºC (tổng lượng cồn cần dùng để hòa tan là 100ml) cho đến khi hòa tan hết.
- Sau đó, thêm 1 ml HCl đậm đặc.
d. Dung dịch axit periodic 5%
Axit periodic: 0,5g
Nước cất: 100ml
e. Dung dịch biệt hóa cồn - axit
Cồn 70 độ: 100ml
HCl: 1ml
6.2. Tiến hành kỹ thuật
1. Tẩy parafin bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút
2. Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút
3. Rửa nước
4. Oxy hóa trong permanganat kali (5 - 10 phút)
5. Rửa nước
6. Tẩy trắng trong axit oxalic (nhìn cho tới trắng)
7. Rửa nước chảy, rồi rửa lại bằng nước cất
8. Axit periodic 5% trong 5 phút
9. Rửa nước chảy, rồi rửa lại bằng nước cất
10. Nhuộm orcein trong lò vi sóng ở công suất thấp trong 30 – 45 giây, rồi tiếp tục để như vậy trong 30 phút. Kiểm tra dưới kính hiển vi, có thể nhuộm lại nếu chưa đủ màu đen.
11. Rửa trong cồn 70 độ
12. Biệt hóa trong cồn-axit 1% cho tới khi không còn phẩm màu chảy ra từ mảnh cắt.
13. Rửa bằng cồn 70 độ
14. Làm mất nước nhanh bằng cồn 95º và cồn tuyệt đối
15. Làm trong bằng 3 bể toluen sạch
16. Gắn lá kính như thường lệ
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Kháng nguyên HBsAg, sợi chun: Đỏ tía
- Các protein liên kết với đồng : Đỏ tía sẫm
- Nền: Đỏ tía ánh nâu nhạt
V. MỘT SỐ LƯU Ý
Các kháng nguyên này thường tập trung thành hạt to, nhỏ khác nhau trong bào tương tế bào gan. Trường hợp hạt nhỏ, thường ở dạng lan tỏa, trong khi, dạng hạt lớn hơn, có hình tròn hoặc bầu dục lại tụ thành nhóm.
Theo Quyết định Số: 5199 /QĐ-BYT