+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Giải phẫu bệnh (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-73.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-110.html)
+---- Chủ đề: Nhuộm bạc Wathrin- Starry phát hiện Helicobacter pylori (/thread-5537.html)
Nhuộm bạc Wathrin- Starry phát hiện Helicobacter pylori - tuyenlab - 11-27-2015
NHUỘM BẠC WARTHIN – STARRY
PHÁT HIỆN HELICOBACTER PYLORI
PHÁT HIỆN HELICOBACTER PYLORI
I. NGUYÊN LÝ
Kỹ thuật này dùng để phát hiện xoắn khuẩn và Helicobacter pylori cùng một số loại vi khuẩn khác. Cơ sở của kỹ thuật là dựa vào khả năng của một số vi khuẩn có thể gắn với ion bạc có trong dung dịch. Sau bước gắn ion bạc, mảnh mô được tiếp xúc với chất khử hydroquinon, nhờ đó, các ion bạc đã gắn với mô và vi khuẩn có thể chuyển ngược trở thành bạc kim loại nhìn thấy được.
Trước khi nhuộm, mảnh mô được xử lý làm tăng tính mẫn cảm với phức hợp bạc. Dung dịch nước của bạc nitrat có gia thêm chất khử hydroquinon để giúp tạo ra phức hợp diamin bạc.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02
2. Phương tiện, hóa chất
2.1. Phương tiện, hóa chất chung
- Dung dịch cố định bệnh phẩm.
- Cồn (70o, 80o, 95o , 100o).
- Xylen hay toluen.
- Nước cất 2 lần.
- Parafin.
- Sáp ong.
- Albumin + glyxerin.
- Máy đo độ pH điện tử.
- Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
- Máy đúc khối parafin.
- Bàn hơ dùng điện.
- Máy cắt lát mỏng (microtome).
- Lưỡi dao cắt lát mỏng.
- Lò nấu parafin.
- Tủ ấm 37o và 56o.
- Tủ lạnh.
- Điều hòa nhiệt độ.
- Tủ hốt phòng thí nghiệm.
- Nguồn cấp nước chảy.
- Bể nhuộm bằng thủy tinh.
- Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.
- Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.
- Khuôn nhựa.
- Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
- Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
- Kẹp không mấu, kéo.
- Cân phân tích.
- Giấy lọc.
- Phiến kính, lá kính.
- Axit picric ngâm, làm sạch phiến kính.
- Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.
- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
- Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
2.2. Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây), bao gồm: bạc nitrat, sodium thiosunfat, axit acetic, hydroquinon, gelatin.
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Cố định
Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 -30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
2. Chuyển bệnh phẩm
3. Vùi parafin
4. Đúc khối parafin
5. Cắt và dán mảnh cắt
6. Nhuộm mảnh cắt
6.1. Chuẩn bị phẩm nhuộm
a. Pha dấm
Axit acetic 1,2%: 10ml
Nước cất: 1000ml
Dung dịch này chỉ để được tối đa 3 tuần.
b. Dung dịch tẩm (ngấm)
Dung dịch bạc nitrat 6%: 10ml
Dấm: 50ml
Dung dịch được đựng trong bể có nắp đậy, khuấy lên rồi cho vào bể nước nóng được hâm nóng tới 60ºC. Không sử dụng bất cứ dụng cụ nào bằng kim loại.
c. Dung dịch tráng
- Chuẩn bị: 60ml dấm kèm 2 thìa gelatin đựng trong bể có nắp đậy và đặt trong bể nước nóng được hâm tới 60ºC. Thỉnh thoảng khuấy lên. Gelatin cần phải tan hoàn toàn.
- Cuối cùng, thêm 2 thìa hydroquinon và trộn kỹ. Thêm 3ml dung dịch tẩm (ngấm) nóng và trộn kỹ.
Lưu ý: các mảnh cắt cần đặt ngay vào dung dịch tráng vừa mới pha.
6.2. Tiến hành kỹ thuật
1. Tẩy parafin mảnh cắt bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút
2. Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút
3. Rửa nước
4. Nhấn chìm mảnh cắt trong bể nước đã làm mất ion (bể đựng nước này phải rửa sạch).
5. Ủ trong bạc nitrat 1% (AgNO3) x 30 – 60 phút ở nhiệt độ 45 - 60°C.
6. Chuẩn bị thuốc hiện hình (developer).
7. Ủ trong thuốc hiện hình 1 phút ở 56°C.
8. Soi kiểm tra sự bắt màu trên kính hiển vi.
9. Rửa dưới vòi nước ấm để ngừng phản ứng.
10. Rửa bằng nước cất nóng ở 56°C.
11. Rửa bằng nước cất lạnh.
12. Ủ trong sodium thiosunfat 2 – 5% x 1 phút.
13. Rửa bằng nước cất.
14. Làm mất nước nhanh bằng cồn 95º và cồn tuyệt đối
15. Làm trong bằng 3 bể toluen sạch
16. Gắn lá kính bằng bôm Canada
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Vi khuẩn: Đen
- Mô nền: Vàng tươi
V. MỘT SỐ SAI SÓT VÀ CÁCH XỬ TRÍ
Nên sử dụng mảnh cắt chứng để đánh giá tính khách quan của kỹ thuật. Ở bước 7, bước quan trọng nhất của kỹ thuật, mảnh cắt được nhuộm một cách lý tưởng khi có màu nâu – vàng sáng (nhìn bằng mắt thường). Cần thay đổi thời gian tráng khác nhau tùy theo mảnh cắt để có thể đạt được kết quả tối đa.
Theo Quyết định Số: 5199 /QĐ-BYT