Những kỹ thuật cơ bản trong giải phẫu bệnh

1. Đối chiếu tên ghi trên lọ đựng bệnh phẩm với tên ghi trong phiếu xét nghiệm giải phẫu bệnh lý.

2. Kiểm tra phiếu xét nghiệm giải phẫu bệnh lý có đủ 3 yêu cầu:

- Phần của bệnh viện:

+ Sơ lược bệnh lý

+ Các xét nghiệm trước ( đặc biệt giải phẫu bệnh)

- Phần của bệnh phẩm:

+ Bệnh phẩm là mô gì

+ Cách sinh thiết

+ Ngày cố định

+ Chất cố định

- Phần mô tả đại thể

Kiểm tra sự mô tả (hay hình vẽ mô tả) của bác sĩ lâm sàng có đủ để người bác sỹ giải phẫu bệnh lý lưu ý đến tổn thương.

3. Vào sổ khoa giải phẫu bệnh lý:

Lần lượt cho mã số vào 3 phần:

- Sổ giải phẫu bệnh lý (sổ giải phẫu bệnh lý gồm: SST, mã số, tên, tuổi, bác sĩ điều trị, bệnh viện, ngày ký nhận)

- Lọ, dụng cụ đựng bệnh phẩm

- Biên lai thu nhận

II. CẮT LỌC BỆNH PHẨM

- Vòi nước sạch: để rửa bớt dung dịch cố định hay chất cặn bã còn sót lại trong các bệnh phẩm.

Chú ý: Túi mật và nang buồng trứng không nên rữa nhiều vì dễ làm trốc lớp biểu mô.

- Thước mica: Đo kích thước bệnh phẩm

- Dao: Phải thật sắc để tránh dập mô

+ Dao nhỏ: thường dùng là dao phẫu thuật

+ Dao lớn: để xẻ những mô lớn chắc (tử cung, buồng trứng, dạ dày)

- Kéo: thường dùng kéo mayo để bốc tách mô sâu hay cắt vỏ bọc nang trứng, xẻ dọc ruột

- Nhíp có mấu và không mấu: để kẹp mô khi cắt hoặc gắp những mô vụn.

- Cassette: để chứa bệnh phẩm sau khi cắt.

- Linh tinh: Formol 10%, amoniac để trung hòa bớt formol, thớt, xà phòng, bàn chải, sọt rác, xô hoặc vật dụng để lưu bệnh phẩm còn lại sau cắt lọc,

b. Người cắt lọc: khẩu trang, găng tay, áo …

2. Tiến hành cắt lọc:

Bước 1: Đối chiếu mã số, tên tuổi giữa bệnh phẩm và phiếu xét nghiệm giải phẫu bệnh lý.

Lưu ý: trước khi mô tả đại thể, nên cho bệnh phẩm đi qua dung dịch amoniac sẽ làm trung hòa bớt mùi formol.

Bước 2: Mô tả đại thể (của người bác sĩ giải phẫu bệnh lý)

- Mô bệnh phẩm là gì? Bệnh phẩm kèm theo. Ví dụ: Dạ dày kèm theo mạc nối lớn

- Quan sát những đặc điểm về hình thái, màu sắc bên ngoài.

- Đo cụ thể kích thước theo không gian 3 chiều của bệnh phẩm.

+ Lấy số đo lớn nhất trên từng bệnh phẩm.

+ Nếu bệnh phẩm đã xẻ phải sắp lại như ban đầu rồi mới đo.

- Mô tả bệnh phẩm từ ngoài vào trong hay ngược lại. Bề mặt trơn láng hay chồi sùi, tính chất dịch trong nang, màu sắc diện cắt.

Ví dụ: Nang buồng trứng, bề mặt trơn láng hay sần sùi, xẻ ra bên trong có dịch trong hay nhày kèm theo có tóc. Xương răng…

· Ghi ngắn gọn, dễ hiểu, không viết tắt.

· Mô tả phải chính xác, rõ ràng, nên tập trung và đánh giá vị trí của tổn thương và mối liên quan với vùng cạnh tổn thương.

· Tránh mô tả quá chi tiết cấu trúc giải phẩu bình thường.

Bước 3: tiến hành cắt: (chỉ nói phần nguyên tắc cắt lọc, còn cụ thể từng cơ quan xem ở phần sau)

- Cắt lọc bệnh phẩm phải đúng và đủ những phần mình muốn lấy

+ Mẫu cắt phải đại diện cho một vùng hoặc một cơ quan của mô bệnh phẩm đó

+ Vùng ranh giới giữa mô lành và mô bệnh hay giữa vùng có hình thái mô học khác nhau.

+ Bổ sung những thông tin cần thiết, ví dụ: polyp, xâm lấn,…

- Mặt cắt phải sắc và phẳng để khi đúc khối, mặt cắt phải nằm dưới, khi cắt lát mỏng, mặt tiếp với diện mỏng được lấy hết toàn diện. Động tác nhẹ nhàng tránh dập mô.

- Đối với mô bệnh phẩm lớn thì dùng dao xẻ dọc (mô đặc) hoặc dùng dao cắt ( mô tạng rỗng) mô tả phần tổn thương đến phần lành, đo kích thước vùng tổn thương bên trong về hình thái, màu sắc. Mỗi mẫu thường lấy với kích thước 3x0.2 cm.

- Các mẫu thử đặt trong cassette có mẫu giấy ghi mã số (nếu lấy nhiều hơn phải ghi rõ lấy nơi nào, đánh số la mã để phân biệt). Ghi vào phiếu GPB số cassette của 1 mẫu bệnh phẩm, mỗi cassette có bao nhiêu mô nhỏ.

- Bệnh phẩm còn ghi lại ngâm vào formol 10% và lưu lại trong một tháng, nếu cần cắt lọc thêm.

- Sau khi cắt lọc từng benh phẩm phải rữa dụng cụ thật sạch để tránh lẫn bệnh phẩm.

- Đối với tạng đặc cần phải cắt lát để xem tổn thương bên trong, không nên cắt rời để sau này cần kiểm tra bệnh phẩm dễ dàng hơn và có thể biết được đã cắt vùng nào để cẩn mô.

KHỬ NƯỚC – LÀM TRONG SÁNG THẤM MÔ – CẨN MÔ

Sau khi cắt lọc, cho mẫu mô vào cassette (cassette đã được ghi mã số của phiếu giải phẫu bệnh lý)

KHỬ NƯỚC LÀM TRONG SÁNG MÔ – THẤM MÔ

- Được thực hiện bằng máy dọn mô tự động (autotechnicon) theo nguyên tắc sau:

Giai đoạn 1: Loại nước ra khỏi mô và tế bào bằng dung dịch Formol 10%, do đó thời gian ở giai đoạn này rất lâu (4 giờ).

Giai đoạn 2: Loại formol 10% ra khỏi mô và tế bào bằng dung dịch alcool.

Giai đoạn 3: Sau khi đã loại Formol ra, nhưng mô còn ngấm Alcool, lúc này mô teo ngắt lại, cứng, dễ vỡ. Do đó ta phải loại Alcool ra bằng Xilen.

Giai đoạn 4: Xilen một mặt loại Alcool ra, mặt khác nó còn giúp “dọn đường”, tạo điều kiện dễ dàng cho parafin thấm nhập vào các ngóc ngách của mô làm cho mô có độ cứng vừa phải, tạo thuận lợi cho việc cắt mỏng sau này.

Máy autotechnicon lần lượt dọn mô các mẫu mô vào các dung dịch có sẵn trong các ngăn theo nguyên tắc trên:

Các dung dịch thứ tự là:

Sau khi ngâm trong parraffin 2 xong thì máy tự động ngưng. Thời gian tổng cộng là 16 giờ.

Thực tế tại bộ môn giải phẫu bệnh:

Bắt đầu cho máy chạy lúc 15 giờ 30 và sáng hôm sau máy tự động ngưng lúc 7 giờ 30.

Còn ngày thứ sáu cuối tuần thì phải chỉnh thời gian dài thêm (vì ngày thứ hai tuần sau mới lấy mẫu mô ra) và thời gian dài thêm ra sẽ xảy ra ở ngăn formol 10%. Máy sẽ ngâm mô ở dd Formol 10% thêm 24 giờ nữa.

* Điều này lại không tốt khi chúng ta muốn nhuộm mô đó bằng phương pháp hóa mô miễn dịch vì ngâm mô trong dung dịch formol 10% quá lâu sẽ làm hư hỏng nhiều kháng nguyên. Thời gian tối đa cho phép cố định mô trong dung dịch formol 10% là 24 giờ.

CẨN MÔ (ĐÚC KHỐI)

Giữ mô trong khối sáp giúp dễ cắt mỏng mà không bị hỏng mô (cắt khối sáp bằng máy vi thiết).

- Lò hấp Arthus Thomas, điều chỉnh nhiệt độ 40[sup]0[/sup]C, mục đích giữ sáp ở thể lỏng.

- Hai thỏi nhôm để tạo khung cho việc đúc khối.

- Đèn, cồn, dao, nhíp, giá nóng …

- Lấy mẫu mô ra cùng với giấy ghi mã số để lên giá nóng cho tan sáp và mẫu mô mềm ra.

- Kế đến sắp hai thỏi nhôm trên nền một mặt kính. Sắp xếp hai thỏi nhôm thành những khung nhỏ hay to tùy theo kích thước mẫu mô.

- Đổ sáp vào gần đầy khung.

- Gắp mô vùi nhanh vào trong đáy của khối sáp (mảnh giấy ghi mã số luôn kèm với mô).

- Khi vùi chú ý mặt cắt sao cho khi xem dưới kính hiển vi phải thỏa điều kiện.

+ Đại diện cho mẫu mô đó.

+ Là ranh giới giữa mô bệnh và mô bình thường hay giữa hai vùng có hình thái mô học khác nhau.

- Sau khi chọn xong ta phải nhanh chóng áp mặt cắt đó xuống sát đáy của khối sáp. Nếu làm chậm khi thực hiện việc cắt mỏng sẽ khó khăn.

- Đặt khối sáp vừa đúc vào tủ lạnh để sáp cứng lại. Sau đó gỡ khung ra, cố định mã số vào khối sáp.

- Máy vi thiết (Microtome).

- Chậu nước có nhiệt độ 40[sup]0[/sup]C.

- Dung dịch Alcool và ống nhỏ giọt.

- Lame được tráng bằng DD Albumin & Glycerine.

2. Kỹ thuật cắt mỏng:

Sau khi khối sáp đông cứng, ta cắt bằng máy vi thiết từng lát mỏng từ 2-4 μm. Ban đầu ta cắt vài lát để cho toàn bộ khối sáp và mô trình diện hết, sau đó cắt 2 – 3 lát dán lên lame.

Dán lát cắt lên lame, nhỏ một dung dịch alcool vào mép lát c ắt để alcool loang ra giữa lát cắt và lame kính, sau đó nhúng nước. Mục đích của hai động tác trên chỉ để lát cắt giãn ra, căng ra và mềm mại. Sau đó ta vớt lên lame kính sao cho lát cắt nằm cân đối trên lame.

Ghi mã số bằng bút chì mỗi lame.

Để lame kính lên lò sấy để sáp tan ra và mẫu mô được dán chặt vào lame. Cuối cùng cho lame vào khay để chuẩn bị nhuộm.

CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM

A. NHUỘM HE (Hemetoxyline – Eosine)

- Khay thủy tinh có nắp để đựng hóa chất.

- Giá thủy tinh đựng lame.

- Pha sẵn các dung dịch: Alcool, Xilen, Hematoxiline Harris, Alcool acid, NH[sub]3[/sub], Eosin.

- Vòi nước, đồng hồ, khung gỗ đựng lame.

II. Kỹ thuật nhuộm: phiến mô đã được sấy khô đặt vào giá thủy tinh và lượt nhúng vào các dung dịch sau:

5. Alcool 100[sup]0[/sup] 1’.

6. Alcool 95[sup]0[/sup] 1’.

7. Alcool 80[sup]0[/sup] 1’.

8. Alcool 70[sup]0 [/sup]1’.

10. Hematoxiline – Harris 5’.

12. Alcool – acid 1%, nhúng.

16. Alcool 95[sup]0[/sup] 1’.

17. Eosine 1 – 2’.

18. Alcool 90[sup]0[/sup] 2’.

19. Alcool 90[sup]0[/sup]1’.
Chọn mẫu mô đẹp giữ lại 2 lát, để khô tự nhiên.

- Xếp lame ra khay gỗ để khô.

- Dán lame kính bằng keo Permout (chú ý đừng để lọt khí)

- Dùng bút lông viết mã số vào lame.

- Xếp lame theo thứ tự lên khung gỗ.

B. NHUỘM PAP (Papanicolaou)

- Xem những phết mỏng của các tế bào tróc ra từ những vùng như cổ tử cung, ậm đạo, khí quản, …

- Xem những tế bào trong nước tiểu và nước não tủy hay trong những thể dịch lấy từ xoang màng phổi và xoang màng bụng.

- Dung dịch Alcool – Ether (2 phần bằng nhau) dùng để cố định lame để phết mỏng tế bào (dịch cơ thể …).

Lame phết mỏng được định hình bằng dung dịch Alcool – Ether, rồi lần lượt nhúng vào các dung dịch sau:

1. Alcool 95[sup]0[/sup] 30’.

2. Alcool 70[sup]0[/sup] 1’.

3. Rửa nước 1’.

4. Hematoxiline 2’.

5. Rửa nước 1’.

6. Acide Alcool nhúng

7. Rửa nước 1’.

8. Alcool 70[sup]0[/sup] 1’.

9. Alcool 90[sup]0[/sup] 2’.

11. Alcool 95[sup]0[/sup] 2’.

12. Alcool 95[sup]0[/sup] 1’.

14. Alcool 95[sup]0[/sup] 2’.

15. Alcool 95[sup]0[/sup] 2’.

16. Alcool 100[sup]0[/sup] 1’.

17. Alcool 100[sup]0[/sup] 1’.

18. Xylen để khô dán lên lame.

- Giống như HE, nhưng thêm dung dịch Acide Periodic 0,5%, dung dịch Coleman.

5. Alcool 100[sup]0[/sup] 1’.

6. Alcool 95[sup]0[/sup] 1’.

7. Alcool 80[sup]0[/sup] 1’.

8. Alcool 70[sup]0[/sup] 1’.

12. Hematoxiline 1’.

14. Alcool 95[sup]0[/sup] 1’.

15. Alcool 100[sup]0[/sup] 1’ để khô.

Để khô dán bằng keo Permout.

5. Alcool 100[sup]0[/sup] 1’.

6. Alcool 95[sup]0 [/sup] 1’.

7. Alcool 80[sup]0[/sup] 1’.

8. Alcool 70[sup]0[/sup] 1’.

10. Nhỏ Giemsa 2’.

12. Alcool 95[sup]0[/sup] 1’.

13. Alcool 100[sup]0[/sup] 1’ để khô.

Để khô, dán lame.

PHIẾU GIẢI PHẪU BỆNH

Lần lượt cho 3 mã số vào 3 phần:

*Số Giải phẫu bệnh

*Lọ đựng bệnh phẩm

*Biên lai thu bệnh phẩm

I. MÔ TẢ TỔNG QUÁT

A. Phần của bệnh viện:

- Sơ lược bệnh lý

- Các xét nghiệm trước đó

B. Phần bệnh phẩm

- Mô bệnh phẩm là gì

- Chất cố định

- Ngày cố định

C. Phần mô tả đại thể:

Kiểm tra sự mô tả (hay hình vẽ mô tả) của Bác sĩ lâm sàng có đủ để Bác sĩ giải phẫu bệnh lý lưu ý đến tổn thương.

II. MÔ TẢ VI THỂ:

Do Bác sĩ giải phẫu bệnh mô tả và ghi theo mã số quyết định.

Kết hợp giữa chẩn đoán lâm sàng và chẩn đoán vi thể.