+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Vi sinh Y học (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-71.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-98.html)
+---- Chủ đề: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM TÌM HP (/thread-2930.html)
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM TÌM HP - phuhmtu - 10-19-2013
Mất hơn 400 năm kể từ công bố đầu tiên về trường hợp loét dạ dày của Donati năm 1586, nhiều thế hệ thầy thuốc đã cố gắng tìm hiểu nguyên nhân của bệnh loét dạ dày- tá tràng; Mất hơn 100 năm, kể từ thời Robert Koch và Louis Pasteur khám phá ra vi sinh vật là căn nguyên của bệnh truyền nhiễm, mối quan hệ giữa Helicobacter pylori (H. pylori) và bệnh loét dạ dày- tá tràng mới được phát hiện. Việc phân lập thành công vi khuẩn H. pylori của Marshall và Warren năm 1983 thực sự là một trong những khám phá lớn của y học trong thế kỷ 20. Sau phát hiện của Marshall và Warren, rất nhiều nghiên cứu về H. pylori đã được công bố. Ngày nay vi khuẩn này đã được thừa nhận là nguyên nhân chủ yếu gây viêm, loét dạ dày - tá tràng, có vai trò quan trọng trong bệnh sinh của ung thư dạ dày. Phát hiện này đã làm thay đổi hẳn quan niệm và phương thức điều trị bệnh dạ dày-tá tràng. Các liệu pháp diệt trừ H. pylori đã làm giảm hẳn tỉ lệ của bệnh loét dạ dày - tá tràng cũng như tỉ lệ phải điều trị ngoại khoa đối với loại bệnh này [Marshall BJ]. Đánh giá cao phát hiện của Marshal và Warren đối với y học thế giới, Hội đồng xét tặng giải thưởng Nobel đã nhất trí trao giải Nobel y học năm 2005 cho hai ông về việc phát hiện ra vi khuẩn H. pylori - thủ phạm gây bệnh ở dạ dày-tá tràng.
Về hình thái và đặc tính sinh học
Tại sao H. pylori có khả năng tồn tại lâu dài ở dạ dày, trong môi trường độ pH thường xuyên là 2,5 đến 3,0 ? Điều này liên quan đến một enzyme của H. pylori có tên là urease. Enzyme này có hoạt tính rất cao làm phân huỷ ure trong dịch dạ dày tạo thành một lớp đệm amonia bao quanh vi khuẩn khiến chúng có thể chịu đựng được môi trường axit của dạ dày. Tuy nhiên khi ra khỏi cơ thể, H. pylori dễ bị diệt bởi các thuốc sát trùng thông thường.
Liên quan đến khả năng gây bệnh của H. pylori, hai độc tố quan trọng được đề cập đến nhiều là CagA (Cytotoxin associated gen A) và VacA (Vacuolating cytotoxin A). Những chủng có biểu hiện đồng thời cả CagA và VacA có vai trò gây bệnh rõ rệt, những chủng này được gọi là “chủng độc” và được xếp vào type I, phân biệt với type II (không có CagA và VacA) ít có khả năng gây bệnh hơn [6].
Về khả năng gây bệnh
H. pylori đã được khẳng định là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh ở dạ dày-tá tràng (bao gồm viêm, loét dạ dày-tá tràng và ung thư dạ dày). Khoảng 90% - 95% các trường hợp loét tá tràng và 70% - 75% các trường hợp loét dạ dày được khẳng định do H. pylori. Với ung thư dạ dày, từ 1994 H. pylori đã được WHO (Tổ chức Y tế thế giới) xếp vào nhóm I các tác nhân gây ung thư dạ dày. Hai dạng của ung thư đã được xác định có liên quan đến H. pylori: U lympho (lymphoma) và ung thư biểu mô tuyến (adenocarcinoma) của dạ dày.
Dịch tễ học
Những nghiên cứu về dịch tễ học cho biết H. pylori phân bố ở khắp các khu vực, quốc gia trên thế giới, tỉ lệ nhiễm chiếm tới hơn 50% dân số. Đường lây truyền chủ yếu là từ người sang người qua đường tiêu hóa. Tuy nhiên mức độ lưu hành H. pylori giữa các vùng, các quốc gia khác nhau phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó tình trạng kinh tế xã hội được coi là yếu tố quan trọng nhất. Nhìn chung tỉ lệ nhiễm H. pylori ở các nước phát triển thấp hơn so với các nước đang phát triển. ở các nước phát triển tỉ lệ nhiễm H. pylori khoảng 20% ở độ tuổi dưới 40 và 50% ở độ tuổi từ 60 trở lên. ở các nước đang phát triển trẻ em bị nhiễm từ rất sớm, tỉ lệ 50% ở trẻ 5 tuổi và tăng lên đến 70% - 90% ở người trưởng thành, tuy nhiên tỉ lệ nhiễm không giống nhau trong các nước đang phát triển. Một số nghiên cứu trong nước cho biết tỉ lệ nhiễm H. pylori ở Việt Nam khoảng 60-70% trong quần thể dân cư [1,5].
Các phương pháp chẩn đoán nhiễm trùng H. pylori
Có nhiều phương pháp phát hiện tình trạng nhiễm H. pylori. Căn cứ vào việc có yêu cầu nội soi hay không, các phương pháp này được chia ra thành hai nhóm: nhóm các phương pháp xâm phạm (invasive methods) và nhóm các phương pháp không xâm phạm (non-invasive methods).
Các phương pháp xâm phạm (invasive methods): Đòi hỏi phải tiến hành thủ thuật nội soi và sinh thiết dạ dày- tá tràng, bao gồm:
Phương pháp nhuộm soi trực tiếp:
Mảnh sinh thiết được áp trực tiếp lên lam kính, dàn mỏng và in dấu trên lam kính, để khô tự nhiên hoặc cố định trên đèn cồn, rồi nhuộm để soi. Có thể nhuộm theo phương pháp Gram, Giemsa hoặc đỏ fucxin. Thông thường hay dùng phương pháp Gram. Phương pháp nhuộm trực tiếp này đơn giản, nhanh, có thể áp dụng ở tất cả các tuyến có nội soi nhưng kết quả phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của người đọc.
Phương pháp mô bệnh học:
Là một trong những phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong nhóm các phương pháp xâm phạm chẩn đoán H. pylori. Nhuộm H.E và Giemsa được sử dụng thường qui vì rẻ tiền và dễ thực hiện, tuy nhiên độ nhậy thấp (33%- 90% tuỳ kinh nghiệm của các nhà giải phẫu bệnh). Các phương pháp nhuộm tẩm bạc (Dieterle, Warthin-Starry, Steiner, Genta), nhuộm hoá-mô-miễn dịch (immunohistochemical) có độ nhậy cao trên 90% nhưng đắt tiền và phức tạp.
Urease tests
Do H. pylori sản xuất ra enzyme urease có hoạt tính rất cao để phân hủy ure, vì vậy nguyên tắc của phương pháp là đưa mảnh sinh thiết vào một lượng nhỏ dung dịch ure có chỉ thị màu. Hoạt tính urease của vi khuẩn (nếu có) sẽ nhanh chóng phân hủy ure thành ammoniac làm môi trường trở thành kiềm hóa và chỉ thị màu sẽ thay đổi. Thử nghiệm urease tốt nhất được đọc trong vòng 24 giờ đồng hồ, ngoài thời gian đó, độ đặc hiệu của nó sẽ giảm vì xuất hiện hoạt tính urease của tổ chức mô và của các vi khuẩn bội nhiễm khác. Nếu thử nghiệm dương tính trong vòng 20 phút thì hầu như không có dương tính giả (độ đặc hiệu được coi như 100%) vì urease của H. pylori có hoạt tính cao hơn bất cứ tế bào nào đã biết hiện nay. Khi số lượng vi khuẩn ít (dưới 105) trong mảnh sinh thiết thì hay xảy ra âm tính giả.
Nuôi cấy:
Nuôi cấy được coi là phương pháp chuẩn để xác minh sự có mặt của H. pylori trong bệnh phẩm. Phương pháp này còn cho phép xác định tính nhậy cảm kháng sinh của vi khuẩn và rất cần thiết trong trường hợp bệnh nhân có dị ứng với kháng sinh, hay đã điều trị kháng sinh thất bại. Bệnh phẩm nuôi cấy cần được đặt trong môi trường bảo quản, đem đến phòng xét nghiệm trong vòng 2h, nếu giữ ở 40C có thể trì hoãn tới 5h. Hiện nay môi trường vận chuyển Portagerm pylori (BioMerieux) được coi là tốt nhất vì có thể giữ mảnh sinh thiết tới 2 ngày ở 40C mà không làm ảnh hưởng tới kết quả nuôi cấy. Trường hợp phải lưu giữ mảnh sinh thiết trong thời gian dài cần phải để lạnh âm sâu (ở -700C có thể tới một năm). Tại phòng xét nghiệm vi sinh, bệnh phẩm được cấy lên các môi trường chuyên biệt như Pylori agar, Skirrow 's cải tiến hoặc trên các môi trường Columbia, Brucella, BHI agar có thêm 7 - 10 % máu ngựa hoặc máu cừu tươi, để ở 370C trong điều kiện có 5% O2, 10% CO2, 85% N2 và độ ẩm cao. Sau 3-5 ngày nuôi cấy (có thể đến 14 ngày) có thể nhận thấy các khuẩn lạc tròn, bóng, màu xám trong, đường kính 0,5-1mm, không tan máu hoặc tan máu anpha. Trên tiêu bản nhuộm Gram, hình thể đa số là hình cong, mức độ xoắn không điển hình như trên tiêu bản trực tiếp từ mảnh sinh thiết, có cả hình trực khuẩn. Sau 7 ngày nuôi cấy, có thể thấy xuất hiện các thể hình cầu.
PCR (Polymerase Chain Reaction):
Đây là kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên nguyên lý khuyếch đại gen. Nguyên lý của kỹ thuật là dùng phản ứng chuỗi polymerase cùng với các mồi (primer) gen của H. pylori để khuyếch đại nhiều lần các gen đặc trưng của H. pylori (nếu có) trong bệnh phẩm và dễ dàng chứng minh sự có mặt của chúng. PCR được coi là kỹ thuật có độ nhậy cao nhất trong việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh nói chung cũng như với H. pylori. Hiện nay ứng dụng chủ yếu của PCR là phát hiện H. pylori trong bệnh phẩm sinh thiết dạ dày, nhưng PCR còn được ứng dụng chẩn đoán với nhiều loại bệnh phẩm không xâm phạm khác. PCR chẩn đoán H. pylori trong mảnh sinh thiết dạ dày và dịch dạ dày có độ nhậy và đặc hiệu đạt trên 95%.
Các phương pháp không xâm phạm (non- invasive methods): Bao gồm test thở với urea gắn 14C hoặc 13C, các xét nghiệm huyết thanh học tìm kháng thể và xét nghiệm phân tìm kháng nguyên H. pylori.
Test thở với C phóng xạ (Urea breath tests):
Phương pháp này được coi là tốt nhất trong việc theo dõi điều trị diệt trừ H. pylori. Độ nhậy và độ đặc hiệu của phương pháp được coi là lý tưởng: 95% - 100%. Nguyên tắc của phương pháp là cho bệnh nhân uống một lượng nhỏ ure có gắn đồng vị phóng xạ 14C (hoặc 13C) vào trong dạ dày. Enzym urease của H. pylori (nếu có) sẽ nhanh chóng phân hủy ure-14C (hoặc ure-13C) thành ammoniac và dioxide carbon phóng xạ 14C02 (hoặc 13CO2). Dioxide carbon có hoạt tính phóng xạ này sẽ nhanh chóng chuyển vào máu và đi tới phổi, chúng sẽ được phát hiện qua khí thở ra. Gần đây, người ta thường dùng 13C thay cho 14C, an toàn hơn. Trở ngại chính của phương pháp này là cần phải có dụng cụ để phân tích nồng độ 13CO2 (hoặc 14CO2) trong khí thở ra nên hiện nay phương pháp này mới chỉ được ứng dụng ở một số trung tâm chẩn đoán.
Phương pháp huyết thanh học:
Phương pháp này dựa trên việc tìm kháng thể đặc hiệu kháng H. pylori trong huyết thanh và các dịch tiết của cơ thể. Cho đến nay, chỉ có các xét nghiệm tìm kháng thể trong huyết thanh có độ nhậy và độ đặc hiệu cao và được coi là loại xét nghiệm phù hợp nhất cho các nghiên cứu dịch tễ học. Ngoài ra, nó cũng còn được dùng để đánh giá kết quả điều trị diệt trừ H. pylori. Nồng độ kháng thể giảm xuống một cách có ý nghĩa sau khi thanh toán được nhiễm trùng; trường hợp điều trị thất bại nồng độ kháng thể vẫn giữ nguyên hoặc tăng lên. Tuy nhiên thời gian theo dõi phải từ 3-6 tháng. Các xét nghiệm huyết thanh học dùng trong chẩn đoán H. pylori gồm có: ELISA, Immunoblot, miễn dịch huỳnh quang gián tiếp và xét nghiệm nhanh với máu toàn phần.
Xét nghiệm nước bọt và nước tiểu:
Các xét nghiệm này dựa trên việc phát hiện IgA hoặc IgG (chủ yếu là IgG) kháng H. pylori có trong nước bọt và nước tiểu. Do độ nhậy và độ đặc hiệu thấp nên các xét nghiệm này ít phổ biến. Gần đây, các tác giả Nhật Bản thông báo chế tạo thành công một loại kit chẩn đoán H. pylori phát hiện IgG từ nước tiểu đạt độ nhậy 95%, độ đặc hiệu 87,9% dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch với màng nitrocellulose phủ kháng nguyên H. pylori. Nghiên cứu này mở ra một triển vọng trong nỗ lực đơn giản hoá các phương pháp chẩn đoán không xâm phạm.
Xét nghiệm phân tìm kháng nguyên H. pylori (Faecal test):
Việc phát hiện kháng nguyên H. pylori trong phân trước đây gặp rất nhiều khó khăn do việc xử lý bệnh phẩm phân rất phức tạp. Từ năm 1999, công ty Meridian Diagnostics (USA) đã phát triển kỹ thuật ELISA tìm kháng nguyên H. pylori trong phân và đưa ra một loại kit chẩn đoán đơn giản, có độ nhậy và độ đặc hiệu cao (83-100%), đó là kit HpSA. Loại kit này rất thích hợp để phát hiện H. pylori ở trẻ em cũng như theo dõi H. pylori trước và sau điều trị, nhưng do giá thành cao nên chưa phổ biến [1].
Phòng bệnh do H. pylori
Việc nghiên cứu vacxin H. pylori gặp phẳi khó khăn là bản thân miễn dịch tự nhiên của cơ thể chủ không có khả năng thanh toán được nhiễm trùng. Các nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào các thành phần kháng nguyên quyết định đến khả năng gây bệnh của H. pylori như VacA, CagA, các tiều đơn vị urease A, urease B của enzyme urease. Kháng nguyên BabA tạo điểm bám của H. pylori vào tế bào niêm mạc dạ dày gần đây cũng được nghiên cứu.
Các biện pháp dự phòng chủ yếu hiện nay ở các nước đang pháp triển là sử dụng nguồn nước sạch, không uống chung, ăn chung bát, đũa, thìa, rửa tay trước khi ăn, bỏ thói quen nhai mớm thức ăn cho trẻ [4,5].
Điều trị
Thực tế cho thấy vi khuẩn H. pylori có khả năng đề kháng rất nhanh với những thuốc kháng sinh đưa vào điều trị, cả ở in vivo và invitro [4,5]. Do H. pylori có khả năng kháng thuốc nhanh chóng nên việc điều trị cần phải tuân theo các phác đồ phối hợp thuốc. Phác đồ được lựa chọn đầu tiên là phác đồ bộ 3, gồm một thuốc ức chế bơm axit (PPI – proton pump inhibitor) hoặc RBC (ranitidine bismuth citrate), kết hợp với clarithromycin và amoxicilin hoặc metronidazol. Phác đồ lựa chọn thứ hai sau đó nên là phác đồ bộ 4 gồm có thuốc ức chế bơm axit (PPI), bismuth, metronidazol và tetracyclin.
Khi không có bismuth, phác đồ lựa chọn thứ hai nên là phác đồ bộ 3 dựa trên PPI. Trường hợp này, việc sử dụng clarithromycin nên được dựa trên các kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ.
Chỉ định điều trị H. pylori (theo hướng dẫn Maastricht-2000) [3]
1.Loét dạ dày – tá tràng
2.U mô bạch huyết dưới niêm mạc (MALT)
3.Viêm dạ dày thể teo
4.Sau cắt bỏ ung thư dạ dày
5.Thân nhân trực hệ của bệnh nhân ung thư dạ dày.