Chuẩn đoán trực khuẩn dịch hạch - Phiên bản có thể in +- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan) +-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html) +--- Diễn đàn: Vi sinh Y học (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-71.html) +---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-98.html) +---- Chủ đề: Chuẩn đoán trực khuẩn dịch hạch (/thread-2845.html)

Chuẩn đoán trực khuẩn dịch hạch - phuhmtu - 09-20-2013 MỤC LỤC GIỚI THIỆU A. VI KHUẨN HỌC GIỚI THIỆU Vi khuẩn dịch hạch (Yersinia pestis) xếp vào giống Yersinia, họ Enterobacteriaceae là căn nguyên gây bệnh dịch hạch, được A. Yersin phân lập lần đầu tiên ở Hồng Kông năm 1894. Yersinia pestis là trực khuẩn dài 1-2μm, rộng 0,3-0,7μm, Gram âm. Nhuộm Wayson tiêu bản từ mô vi khuẩn bắt màu đậm xanh ở hai đầu giống chiếc “ghim băng”. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm A. VI KHUẨN HỌC Phân lập xác định Yersinia pestis là phương pháp cơ bản, có giá trị quyết định trong chẩn đoán bệnh dịch hạch. I. Cách lấy máu xét nghiệm 1. Chuột chết: 2. Bọ chét: 3. Người II. Quy trình phân lập vi khuẩn 1. Hình thái vi khuẩn: 2. Nuôi cấy: 3. Tác dụng của phagiơ: 4. Tính chất hoá sinh: 5. Tiêm truyền súc vật: III. Tiêu chuẩn xác định Yersinia Pestis IV. Sơ đồ phân lập xác định vi khuẩn dịch hạch (Yersinia Pestis) B. MIỄN DỊCH HỌC I. CÁCH LẤY MÁU XÉT NGHIỆM 1. Chuột chết: Nếu thấy có nhiều ổ chuột chết tự nhiên nghi ngờ, phải lấy chuột về để xét nghiệm. Dùng kẹp gắp chuột cho vào túi vải, hoặc cho vào lọ thủy tinh có nút, mang về phòng thí nhiệm. Trước khi mở túi hoặc lọ ra cần phải cho một ít bông tẩm ête hoặc clorofoc để gây mê bọ chét nếu có trên than chuột. Tìm bọ chét trong lông chuột, lấy kẹp gắp ra. Một số bọ chét được đem nghiền trong cối để nuôi cấy vi khuẩn, một số được ngâm vào cồn 90o gửi đến phòng côn trùng để phân loại. Để tránh cho xác bọ chét bị thối rữa, nên cho xác bọ chét vào lọ thủy tinh có chứa dung dịch NaCl 2%o. Mổ xác chuột lấy phủ tạng để xét nghiệm. Lấy một ít phủ tạng: gan, lách, phổi, hạch cho vào lọ thủy tinh gửi đến phòng xét nghiệm. Các chai lọ cần được bảo quản lạnh trong thời gian vận chuyển. Nếu ở xa phòng thí nghiệm, các phủ tạng của chuột cần được giữ trong môi trường vận chuyển Cary – Blair. 2. Bọ chét: Chải bọ chét trên xác chuột bằng bàn chải. Có thể dùng ống hút bọ chét cho vào lọ, hoặc lấy kẹp gắp bọ chét ra. Nghiền khoảng 25-30 con trong cối sứ với một ít nước muối NaCl 9%o. 3. Người: a. Người bệnh: - Mủ hạnh: Chọc bằng kim to. Ống tiêm vô khuẩn chứa 0,2-0,5 ml NaCl 9%o bơm vào hạch bệnh nhân sau đó hút lấy chất dịch. Lấy tăm bông vô khuẩn thấm dịch hút cho vào lọ đã có sẵn môi trường vận chuyển (trong trường hợp ở xa phòng thí nghiệm) -Máu: Lấy 10ml máu tĩnh mạch khi người bệnh đang sốt cấy vào canh thang: 5ml; còn 5ml để tiêm chuột và làm phản ứng ngưng kết huyết thanh. Có thể cho 4-5 giọt máu thấm vào đầu một tăm bông vô khuẩn, cho vào lọ môi trường vận chuyển để nuôi cấy. -Nhày họng, đờm khi bị thể phổi: Dùng tăm bông vô khuẩn lấy ở phần sau họng, hai hạch hạnh nhân, chỗ sưng bị chảy nước, chỗ loét, rồi cho tăm bông vào lọ có môi trường vận chuyển. Lấy đờm chứ không lấy nước bọt. -Dịch não tủy ở thể viêm màng não: 2ml – 5ml. b. Người chết: Lấy hạch, gan, lách, phổi, máu tim… Nếu ở xa phòng xét nghiệm thì bệnh phẩm được cho vào môi trường vận chuyển Cary – Blair. II. QUY TRÌNH PHÂN LẬP VI KHUẨN Phòng xét nghiệm vi khuẩn dịch hachk cần riêng biệt. Nhân viên làm việc được mặc quần áo, đeo găng để bảo vệ nhiễm khuẩn và đề phòng bọ chét chui vào quần áo. Tuyệt đối tôn trọng quy trình vô khuẩn và sát khuẩn. Chuột chết, bệnh phẩm phải được sấy ướt 120oC/1 giờ. 1. Hình thái vi khuẩn: -Từ mẫu xét nghiệm, khuẩn lạc, canh khuẩn được làm phiến đồ trên lam kính, nhuộm Wayson, soi kính hiển vi khoảng trống ở giữa rỗng không bắt màu. -Trong bệnh phẩm, có thể tìm thấy vi khuẩn ở ngoài và ở trong bạch cầu. Khi tìm thấy vi khuẩn dịch hạch ở trong bạch cầu thì có nhiều giá trị chẩn đoán hơn. -Kỹ thuật nhuộm Wayson: Nhỏ vài giọt cồn 90o lên phiến đồ đã khô, để cồn bốc hơi nhẹ nhàng, phơi khô, soi dưới kính hiển vi. Vi khuẩn Y. pesis bắt màu xanh trên nền hồng hoặc đỏ. -Công thức thuốc nhuộm Wayson: Xanh methylen 0,75g Fuchsin kiềm 0,2g Cồn tuyệt đối 20ml Phenol 5% 200ml Hòa tan 0,75g xanh methylen trong 10ml cồn tuyệt đối và 0,2g fuchsin kiềm trong 10ml cồn tuyệt đối. Sau đó pha lẫn hai dung dịch màu rồi cho thêm 20ml phenol 5% (pha trong nước cất). Sau 24 giờ: đun, lọc, dùng để nhuộm. 2. Nuôi cấy: -Mọc tốt ở 28oC, vừa ưa khí, vừa yếm khí, mọc dễ trên những môi trường thông thường: thạch peptone, thạch Martin, thạch Mac Conkey, canh thang BIH… -Cấy phủ tạng, bệnh phẩm, dịch nghiền bọ chét vào môi trường phân lập: thạch sulfit Na, vi khuẩn mọc chậm, khuẩn lạc ban đầu rất nhỏ, tròn, trong sau đó có núm lồi ở giữa, gồ ghề. -Ở thạch Desoxycholate, sau 48 giờ ở nhiệt độ 28oC khuẩn lạc mọc rất nhỏ, thường hay liên kết nhau thành từng vết mờ, màu hồng nhạt, có chu vi ngoằn ngoèo, giữa có màu đỏ sẫm. -Trên môi trường thạch máu: sau 24 giờ ở nhiệt độ 37oC khuẩn lạc rất nhỏ, tròn bóng, ướt, trong, bề mặt đầy. Nếu để tiếp sau 48 giờ khuẩn lạc lớn hơn, có màu xám, bề mặt lồi lõm không đều. -Trên canh thanh BHI (Hottinger) sau 48 giờ, vi khuẩn lắng xuống đáy ống, một số ít đóng thành một lớp váng mỏng trên mặt nước canh thang, khẽ chạm sẽ rơi xuống đáy ống, môi trường trở nên trong, lắc nhẹ vẩn khói cuộn lên từ đáy ống, đây chính là tính chất đặc trưng của ki khuẩn dịch hạnh trong môi trường lỏng. 3. Tác dụng của phagiơ: Có 3 phương pháp làm dung giải vi khuẩn dịch hạch: -Phương pháp láng canh khuẩn -Phương pháp cấy khuẩn lạc -Phương pháp cải tiến a. Phương pháp láng canh khuẩn: Láng 1ml canh khuẩn dịch hạch đã nuôi cấy 12 giờ trên một đĩa thạch Hottinger, hút hết phần nước còn lại, phơi khô đĩa thạch trong tủ ấm 37oC/10 phút. Nhỏ lên mặt thạch 1 giọt phagiơ. Để đĩa thạch trong tủ ấm 28oC. Sau 24 giờ đọc kết quả. Nếu thấy có một vòng vô khuẩn ở nơi đã nhỏ phagiơ ngày hôm trước thì đúng là Y. pestis. b.Phương pháp cấy khuẩn lạc: Cấy thẳng khuẩn lạc trên thạch Hottinger, rộng khoảng 2cm. Nhỏ vào giữa chỗ vừa cấy vi khuẩn 1 giọt phagiơ. Để thạch vào tủ ấm 28oC. Sau 8-10 giờ đọc kết quả. Nếu thấy có một vòng tròn vô khuẩn tại nơi nhỏ giọt phagiơ thì đúng là Y. pestis. c.Phương pháp cải tiến: Nhỏ một giọt phagiơ lên nuôi cấy bệnh phẩm trên môi trường phân lập thạch Violet gentiane – Sulfit Natri – máu cừu. Đặt đĩa thcạh vào tủ ấm 28oC. Độ 8 giờ sau thấy 1 vòng vô khuẩn rõ tại nơi nhỏ giọt phagiỏ thì đúng là Y. pestis. 4. Tính chất sinh hóa: - Không di động -Lên men không sinh hơi các đường: glucoza, manit, mantoza, arabinoza, xyloza -Không lên men các đường: lactoza, sacaroza, ramnoza. -Urê, Indol: âm tính -Đỏ metyl, nitrat: dương tính - Glyxerin âm tính hoặc dương tính tùy theo gốc vi khuẩn dịch hạch. Để phân biệt Y. pestis với các loại vi khuẩn Y. pseudotuberculosis và P. multocida (P. septica), người ta đã so sánh đặc tính hóa sinh của chúng như sau: 5. Tiêm truyền súc vật: - Chuột lang, chuột bạch dễ cảm nhiễm. Tiêm dịch nghiền vào dưới da 2 chuột bạch nặng 18-20 gam, mỗi con 0,5ml. Thường chuột chết sau 3-5 ngày. Theo dõi 10 ngày nếu chuột không chết thì bỏ đi. -Chột lang 300 gam, tiêm dưới da 1.5-2ml, theo dõi như trên. Mổ xác chuột chết: nơi tiêm thấy phù thũng, hạch quanh nơi tiêm sưng to, gan ứ máu, lách sưng bầm tím có nhiều nốt mủ trắng hay xám. Trong gan, lách có rất nhiều vi khuẩn dịch hạch. Làm tiêu bản, nhuộm soi thấy vi khuẩn dịch hạch điển hình; cấy phủ tạng trên môi trường. -Xát da chuột lang: Khi phủ tạng của người hay chuột đã thối rữa, bệnh phẩm là đờm, nhầy họng – Cạo lông chuột lang ở sườn, cào xước da cho rớm máu rồi xát bệnh phẩm vào đó. Chuột sẽ chết với những thương tổn giống như tiêm truyền. III. TIÊU CHUẨN XÁC ĐỊNH YERSINIA PESTIS Muốn xác định vi khuẩn dịch hạch, thường căn cứ vào: -Hình thể vi khuẩn (bắt màu đậm 2 đầu, rỗng ở giữa: nhuộm Wayson) -Khuẩn lạc xù xì ® -Bị phagiơ dịch hạch dung giải -Tính chất hóa sinh học -Tiêm truyền: chuột chết, trong phủ tạng có vi khuẩn dịch hạch. IV. SƠ ĐỒ PHÂN LẬP XÁC ĐỊNH VI KHUẨN DỊCH HẠCH (YERSINIA PERTIS) B. MIỄN DỊCH HỌC: -Dùng phản ứng ngưng kết hông cầu thụ động - Dùng phản ứng ELISA Hai loại phản ứng này để phát hiện kháng nguyên F1 và kháng thể kháng kháng nguyên F1 của vi khuẩn dịch hạch. Phát hiện được kháng thể kháng F1 của vi khuẩn dịch hạch trong huyết thanh động vật gặm nhấm có giá trị trong điều tra dịch tễ học nghiên cứu bệnh dịch hạch. Nguồn: http://www.nihe.org.vn/new-vn/thuong-quy-va-huong-dan-ky-thuat/145/Chuan-doan-vi-khuan-dich-hach-trong-phong-thi-nghiem.vhtm