PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HỌC - Phiên bản có thể in +- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan) +-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html) +--- Diễn đàn: Ký sinh trùng (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-72.html) +---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-107.html) +---- Chủ đề: PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HỌC (/thread-2766.html)

PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HỌC - phuhmtu - 08-28-2013 1. đẠI CƯƠNG – Ký sinh trùng sau khi xâm nhập vào cơ thể bệnh nhân có khả năng kích thích cơ thể sản xuất ra kháng thể đặc hiệu. Vì vậy, các nguyên lý chung về miễn dịch học đều có thể áp dụng được đối với các bệnh ký sinh trùng. – Kỹ thuật miễn dịch được sử dụng trong các trường hợp mà phương pháp trực tiếp không thể làm được như: + Giai đoạn mới nhiễm: KST còn non, chưa đẻ trứng (sán lá gan, sán máng). + Trong giai đoạn mãn tính, KST đóng kén như Toxoplasma. + Mật độ ký sinh thấp như Trypanosoma. + KST định vị trong nội tạng sâu như bệnh amíp ở gan, gạo heo (lợn) ở cơ, não. + Ngõ cụt ký sinh như hội chứng ấu trùng di chuyển, KST ở dạng ấu trùng, không bao giờ tiến đến giai đoạn trưởng thành và không bao giờ hoàn tất chu trình phát triển như Toxocara sp. Trong nhiều trường hợp, huyết thanh miễn dịch học tỏra thực tế hơn, nhất là trong các trường hợp mà cần lấy bệnh phẩm bằng kỹ thuật xâm lấn. 2. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HỌC Phương pháp miễn dịch học áp dụng trong chẩn đoán bệnh KST bao gồm nhiều kỹ thuật như kết tủa, điện di, gắn bổthể, ngưng kết, miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch phóng xạ, miễn dịch men. Trước đây, kỹ thuật miễn dịch chỉ dựa vào kháng nguyên để phát hiện và đo lượng kháng thể luân lưu trong máu và các dịch sinh học. độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm này tùy thuộc chủ yếu vào chất lượng của kháng nguyên, nếu kháng nguyên thô thì cho nhiều phản ứng chéo, dương giả, kết quảdương tính không cho biết được bệnh đang mắc hay đã qua, vì kháng thể giảm rất chậm, từ vài tháng đến cả năm. Vì vậy, việc biện luận kết quảgặp nhiều khó khăn và cần thận trọng. Vài năm gần đây, chúng ta có những bộ thử nghiệm phát hiện kháng nguyên đểchẩn đoán một số bệnh đơn bào như bệnh do Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Trichomonas vaginalisvà bệnh giun chỉ Wuchereria, sán máng Schistosoma sp. So với nhóm trên, các kỹ thuật phát hiện kháng nguyên có giá trị chẩn đoán, kết quả dương tính xác định bệnh đang có. 3. KỸTHUẬT MIỄN DỊCH MEN ELISA (ENZYME – LINKED – IMMUNOSORBENT ASSAY) Kỹ thuật miễn dịch men có nhiều loại: trực tiếp, gián tiếp, kẹp chả, cạnh tranh. Hiện nay, trong chẩn đoán bệnh KST, kỹthuật ELISA gián tiếp được ưa dùng vì nó có độnhạy cao, thao tác đơn giản, ít tốn hóa chất, không đòi hỏi máy móc đắt tiền, có thể làm hàng loạt. Phần mô tả dưới đây là kỹ thuật miễn dịch men ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể trong máu bệnh nhân. 4. KỸTHUẬT MIỄN DỊCH MEN ELISA GIÁN TIẾP PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ Các từ viết tắt: KN–KT = Phức hợp kháng nguyên kháng thể. KKT = KT của động vật kháng với KT của người. Cộng hợp = KKT gắn men. 4.1. Nguyên tắc Kháng nguyên được gắn lên giếng nhựa, khi gặp kháng thể tương ứng sẽkết hợp tạo thành phức hợp KN–KT. Phức hợp KN–KT được phát hiện nhờmen gắn vào KKT, men phản ứng với một cơ chất và làm đổi màu. Kết quả có thể được đọc bằng mắt hoặc máy đọc ELISA. 4.2. Dụng cụ và hóa chất – Ống nghiệm – Giá đựng ống nghiệm – Micropipette có các thểtích khác nhau từ1µ l đến 1000µ l – đầu nhựa gắn vào Micropipette, 2 loại: màu vàng (cho loại nhỏ) và màu xanh dương (cho loại to 100–1000µl) – Bình nhựa đựng nước rửa (0,5 lít, 1 lít) – Giấy thấm để đập cho các giếng ráo nước – Máy đọc ELISA (nếu có thì tốt, không có máy thì đọc kết quả bằng mắt) – Bộ thử nghiệm gồm có: + Các thanh nhựa đã gắn kháng nguyên + Dung dịch rửa + Dung dịch pha loãng huyết thanh + Cộng hợp + Chứng âm + Chứng dương + Cơ chất + Chất ngưng phản ứng (acid hoặc bazơ). 4.3. Quy trình kỹthuật Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Quy trình gồm các bước sau đây: Cho 100µl huyết thanh bệnh nhân, chứng âm, chứng dương vào giếng nhựa đã gắn sẵn kháng nguyên. Ủ ở 37oC trong 1 giờ. Rửa 5 lần các giếng bằng dung dịch đệm PBS – Tween 20. đập cho ráo nước. Cho 100µl cộng hợp vào mỗi giếng, ủ ở37oC trong 1 giờ. Rửa 5 lần các giếng bằng dung dịch đệm PBS – Tween 20. đập cho ráo nước. Cho 100ml cơchất vào mỗi giếng, chờcho màu xuất hiện (15 – 30 phút). Cho acid hoặc bazơvào đểngưng phản ứng. đọc kết quảbằng máy đọc ELISA tự động hoặc bằng mắt. Kết quảdương tính khi có hiện màu, âm tính thì không có màu. 4.4. Biện luận kết quả – Ngưỡng dương tính có thểkhác nhau đối với từng loại bệnh KST. Biện luận kết quảdựa trên ngưỡng dương tính do nhà sản xuất đưa ra. – Các kỹ thuật miễn dịch phát hiện kháng thể cho kết quả gián tiếp, không có giá trị tuyệt đối. – Kết quảâm tính cũng không loại trừhoàn toàn nhiễm KST, có thểdo mới bị nhiễm, hoặc bị nhiễm quá lâu, hoặc lượng KST quá ít đểcó thểkích thích được hệmiễn dịch. Trong trường hợp nghi ngờ trên lâm sàng nên làm lại thửnghiệm. Xét nghiệm vài lần đểtheo dõi biến động của kháng thểcó giá trịhơn là xét nghiệm một lần. Nếu cần, phải kiểm tra lại bằng các kỹthuật khác. – Kết quảdương tính cũng không khẳng định hoàn toàn bịnhiễm KST vì có thểdương tính giảdo phản ứng chéo giữa các loại KST. Vì vậy, các phản ứng miễn dịch tìm kháng thể không thể thay thế hoàn toàn xét nghiệm trực tiếp trong chẩn đoán nguyên nhân bệnh. Kết quảxét nghiệm, dù âm hay dương, cũng cần được xem xét một cách cẩn thận, kết hợp với các yếu tốdịch tễvà triệu chứng lâm sàng. 5. THỬ NGHIỆM NHANH TÌM KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT Phương pháp này có mục đích phát hiện nhanh kháng nguyên hay kháng thể đểchẩn đoán bệnh sốt rét, được thực hiện dưới dạng que nhúng, không đòi hỏi phương tiện gì khác ngoài bộ thử nghiệm. 5.1. Thử nghiệm Parasight F Thử nghiệm này chỉ để chẩn đoán bệnh sốt rét do Plasmodium falciparum, bằng cách dùng kháng thể đơn dòng đặc hiệu đểphát hiện Protein giàu Histidin (HRP–II) do Plasmodium falciparumthải ra trong máu bệnh nhân. a) Dụng cụ và hóa chất – Ống mao quản – Ống nghiệm – Giá để ống nghiệm – Bộ thử nghiệm mua trên thị trường: + Dung dịch ly giải hồng cầu + Cộng hợp KKT– Sulfo–rhodamin B + Dung dịch rửa + Que nhúng là thanh nitrocellulose. b) Quy trình kỹ thuật – Lấy máu đầu ngón tay bằng ống mao quản. – Cho 1 giọt máu vào trong 1 ống nghiệm có sẵn 3 giọt dung dịch ly giải hồng cầu. – Nhỏ1 giọt máu đã bịly giải vào 1 giếng thử. – Nhúng que thửvào giếng thử, chờcho máu thấm lên que thử. – Nhỏ 1 giọt cộng hợp vào giếng nhựa. – Nhỏ 2 giọt nước rửa lên que nhúng đểrửa hết máu. – đọc kết quả: Dương tính: 2 vạch: +1 vạch lien tục = kết quả dương tính +1 vạch đứt đoạn = vạch chứng Âm tính: 1 vạch đứt quãng Thử nghiệm cho kết quả nhanh, trong vòng 10 phút, có độnhạy, độ đặc hiệu từ86 – 95% so với lam máu, nhưng kết quả dương tính không xác định được bệnh đang phát triển hay đã lui. 5.2. Thửnghiệm Optimal – Có thể phát hiện cả 4 loại KST SR gây bệnh ởngười. – Dựa vào việc phát hiện men pLDH (Plasmodium lactate dehydrogenase), là một loại men do ký sinh trùng thải ra. – Men pLDH chỉ được sản xuất ra bởi KST SR còn sống nên thử nghiệm này có khả năng phân biệt KST SR sống hay chết. a) Dụng cụvà hóa chất – Ống mao quản – Ống nghiệm – Giá để ống nghiệm – Bộ thử nghiệm mua trên thị trường. b) Quy trình kỹthuật – Nhỏ1 giọt dung dịch đệm vào giếng thử và 4 giọt vào giếng rửa trên phiến nhựa. – Lấy máu đầu ngón tay bằng ống mao dẫn. – Nhỏ giọt máu vào giếng thử. – Nhúng que thử vào giếng thử theo chiều thẳng đứng, để10 phút cho máu thấm lên que thử. – Chuyển que thửsang giếng rửa. – Sau khi rửa, các vạch đỏ sẽ xuất hiện rõ trên que thử. – đọc kết quả: + Có 1 vạch đỏ: âm tính + Có 2 vạch đỏ: dương tính với 3 loại: P. vivax, P. ovale, P. malariae. + Có 3 vạch đỏ thì dương tính với P. falciparum. + Không có vạch nào: thử nghiệm không có giá trị. CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ 1.Theo anh (chị), chẩn đoán bệnh KST bằng kỹthuật miễn dịch có thểáp dụng cho những trường hợp nào? 2.Tại sao kỹthuật miễn dịch men được sửdụng phổbiến trong chẩn đoán bệnh KST? 3.Nêu nguyên lý của kỹ thuật ELISA. 4.Mô tả kỹ thuật ELISA gián tiếp. 5.Nêu những hạn chếcủa kỹthuật Elisa phát hiện kháng thể. 6.Kỹthuật miễn dịch có thay thế được phương pháp soi trực tiếp trong chẩn đoán bệnh KST? Tại sao? 7.Mô tả thử nghiệm Parasight F. 8. So sánh thửnghiệm Parasight F với phết máu trong chẩn đoán bệnh sốt rét. Kỹ thuật ELISA [table=95][tr][td]STT[/td][td]Thao tác[/td][td]Yêu cầu phải đạt[/td][/tr][tr][td]1[/td][td]Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để làm phản ứng[/td][td]Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để làm phản ứng[/td][/tr][tr][td]2[/td][td]Cho 100µl huyết thanh bệnh nhân, chứng âm, chứng dương vào giếng nhựa đã gắn sẵn kháng nguyên[/td][td]Lấy đúng khối lượng, bệnh phẩm tiếp xúc đều với mặt giếng, không có bọt khí[/td][/tr][tr][td]3[/td][td]Ủ ở37oC trong 1 giờ[/td][td]đúng thời gian theo quy định[/td][/tr][tr][td]4[/td][td]Rửa các giếng bằng dung dịch đệm PBS-Tween 20.[/td][td]Rửa kỹ nhiều lần theo quy định[/td][/tr][tr][td]5[/td][td]đập cho ráo nước. [/td][td]Các giếng phải thật khô[/td][/tr][tr][td]6[/td][td]Cho 100µl cộng hợp vào mỗi giếng[/td][td]Lấy đúng khối lượng[/td][/tr][tr][td]7[/td][td]Ủ ở 37oC trong 1 giờ.[/td][td]đúng thời gian theo quy định[/td][/tr][tr][td]8[/td][td]Rửa các giếng bằng dung dịch đệm PBS - Tween 20.[/td][td]đọc kết quả bằng máy đọc ELISA tự động hoặc bằng mắt[/td][/tr][tr][td]9[/td][td]đập cho ráo nước.[/td][td]Các giếng phải thật khô[/td][/tr][tr][td]10[/td][td]Cho 100µl cơ chất vào mỗi giếng, chờ cho màu xuất hiện[/td][td]Lấy đúng khối lượng[/td][/tr][tr][td]11[/td][td]Cho acid hoặc bazơ vào để ngưng phản ứng[/td][td]Lấy đúng khối Lấy đúng khối lượng. Nhỏ vào giếng đúng theo thời gian quy định[/td][/tr][tr][td]12[/td][td]đọc kết quảbằng máy đọc ELISA tựđộng hoặc bằng mắt[/td][td]đọc trong khoảng thời gian theo quy định[/td][/tr][/table]