+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Vi sinh Y học (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-71.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-98.html)
+---- Chủ đề: XÉT NGHIỆM BỆNH PHẨM DỊCH NÃO TỦY TÌM VI KHUẨN GÂY BỆNH (/thread-2496.html)
XÉT NGHIỆM BỆNH PHẨM DỊCH NÃO TỦY TÌM VI KHUẨN GÂY BỆNH - VuBaVietPhuong - 06-06-2013
MỤC TIÊU HỌC TẬP
1. Kể được tên các vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong bệnh phẩm dịch não tủy
2. Mô tả được cách lấy, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm dịch não tủy để xét nghiệm tìm vi khuẩn gây bệnh
3. Thực hiện được xét nghiệm bệnh phẩm dịch não tủy tìm vi khuẩn gây bệnh
4. Đọc và nhận định được kết quả xét nghiệm bệnh phẩm dịch não tủy
GIỚI THIỆU
Viêm màng não do vi sinh vật là một bệnh cấp tính, nguy hiểm, thường đe dọa tính mạng người bệnh. Vì vậy xác định các tác nhân gây nhiễm là một trong những nhiệm vụ quan trọng nhất của phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng. Dịch não tủy của người bệnh viêm màng não luôn được coi là bệnh phẩm cấp, phải xử lý ngay lập tức để xác định các tác nhân gây bệnh. Đồng thời các kết quả này phải được thông báo ngay cho các bác sỹ điều trị càng sớm càng tốt.
Nuôi cấy là kỹ thuật phổ biến nhất để phát hiện vi khuẩn và nấm gây bệnh. Có thể cấy thêm canh thang để tăng độ phát hiện các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí có nồng độ thấp trong dịch não tủy. Tuy nhiên, một số vi khuẩn nhiễm bẩn có thể phát triển, vì vậy phải thông báo với các bác sĩ để đối chiếu với triệu chứng lâm sàng.
Thử nghiệm phát hiện kháng nguyên trực tiếp hiếm khi được tiến hành vì hiệu quả thấp. Thử nghiệm xác định nhóm huyết thanh Neisseria menigitidis có độ nhạy thấp. Thử nghiệm Haemophilus influenzae serogroup B độ nhạy cao, nhưng hiện nay bệnh đã hầu như biến mất ở các nước đang có chương trình tiêm chủng trẻ sơ sinh. Đối với liên cầu và Escherichia coli K-12, nhuộm Gram thường cho kết quả dương tính, trừ các trường hợp đã được điều trị.
Hiện nay PCR đang trở thành phương pháp lựa chọn để chẩn đoán vì nhanh và nhạy, đặc biệt là khi vi sinh vật có số lượng thấp hoặc khó nuôi cấy như Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma, Streptococcus pneumoniae, Borrelia, Ehrlichia hoặc đã điều trị kháng sinh,
1. CÁC VI KHUẨN THƯỜNG GẶP TRONG BỆNH PHẨM DỊCH NÃO TỦY
Bình thường dịch não tủy là vô trùng, vì vậy khi phát hiện được vi sinh vật, chúng được coi là tác nhân gây nhiễm.
Đôi khi số lượng vi sinh vật trong dịch não tủy có thể thấp 103 CFU/ml, nên việc nhuộm Gram sử dụng máy ly tâm tế bào (cytocentrifugation) là rất quan trọng, giúp cho việc chẩn đoán nhanh. Ly tâm bằng máy ly tâm tế bào có thể tăng độ nhạy lên gấp 100 lần so với không ly tâm và ly tâm máy thông thường. Ly tâm dịch não tủy để nuôi cấy là không cần thiết vì các môi trường đĩa nuôi cấy có thể phát hiện được vi khuẩn với số lượng thấp.
Các vi sinh vật đều có thể gây viêm màng não nhưng vi khuẩn là tác nhân gây bệnh thường gặp nhất. Viêm màng não thường do các vi khuẩn hiếu khí gây ra. Các vi khuẩn kỵ khí thường gây áp xe màng não hoặc chấn thương vùng đầu, ghép tủy, thay đĩa đệm, đặt ống dẫn lưu tủy. Propionibacterium acnes là tác nhân gây bệnh phổ biến do đặt ống dẫn lưu hệ thống thần kinh trung ương, thời gian ủ ấm đối với vi khuẩn kỵ khí tối thiểu là 7 ngày.
Bảng 1. Các vi khuẩn thường gây viêm màng não cấp theo tuổi hoặc tình trạng
Tuổi hoặc tình trạng Vi sinh vật
Sơ sinh E. coli, S. agalactiae (liên cầu nhóm B), L. monocytogenes
Dưới 2 tháng S. agalactiae, L. monocytogenes, E. coli
Dưới 10 tuổi H. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis
Trẻ em N. meningitidis
Người lớn S. pneumoniae, N. meningitidis
Người già S. pneumoniae, trực khuẩn Gram-âm, L. monocytogenes
Đặt ống dẫn lưu hệ thống thần kinh Staphylococcus coagulase-âm, S. aureus, Corynebacterium spp., Propionibacterium acnes, trực khuẩn Gram-âm, một số vi khuẩn kỵ khí khác
2. KỸ THUẬT LẤY, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN BỆNH PHẨM DỊCH NÃO TỦY ĐỂ XÉT NGHIỆM VI KHUẨN GÂY BỆNH
2.1. Chọc dịch não tủy
- Thời điểm và kỹ thuật do bác sỹ lâm sàng.
- Dụng cụ chứa: Ống nghiệm thủy tinh trong, vô trùng, nắp xoáy.
- Thể tích: Khoảng 1-3 ml
2.2. Vận chuyển bệnh phẩm
- Gửi ngay đến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt vì các tác nhân gây bệnh ở dịch não tủy rất dễ chết. Gửi ngay đến phòng xét nghiệm sớm càng tốt, và nhấn mạnh rằng đây là bệnh phẩm cấp.
- Không được bảo quản trong tủ lạnh.
- Ống vô trùng chứa dịch não tủy phải được dán nhãn đúng với tên của bệnh nhân, ngày sinh, và / hoặc mã số duy nhất, và ngày và thời điểm nhận mẫu. Phiếu yêu cầu của bác sỹ phải ghi rõ cách lấy.
- Bổ xung đầy đủ thông tin vào phiếu yêu cầu. Thông tin về chẩn đoán bệnh giúp xử lý bệnh phẩm tốt hơn.
- Hạn chế yêu cầu những người phản ánh tình trạng của bệnh nhân.
2.3. Bảo quản
Nếu chưa gửi ngay, có thể bảo quản ở nhiệt độ 35 - 37oC nhưng không quá 2 tiếng. Tuyệt đối không được bảo quản trong tủ lạnh.
2.4. Các tiêu chí từ chối bệnh phẩm
- Nếu khối lượng không đủ phải thông báo ngay với bác sĩ.
- Nếu bệnh phẩm bị rò rỉ vẫn nên xử lý, nhưng cảnh báo với lâm sàng về khả năng nhiễm bẩn.
3. QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM BỆNH PHẨM DỊCH NÃO TỦY TÌM VI KHUẨN GÂY BỆNH
3.1. Nhận định bệnh phẩm
- Xử lý bệnh phẩm càng sớm càng tốt ngay sau khi nhận được (trong vòng 20 phút sau khi nhận bệnh phẩm). Chú ý: Sử dụng tủ an toàn sinh học để tránh nhiễm bẩn và bảo vệ cho nhân viên.
- Đối chiếu tên bệnh nhân trên cả ống chứa bệnh phẩm và phiếu yêu cầu.
- Ghi lại số lượng của dịch não tủy
- Ghi lại quan sát từ dịch não tủy về độ trong, vẩn đục, sắc vàng, có máu,…
3.2. Nhuộm soi không ly tâm
- Chuẩn bị lam nhuộm: nhỏ 1 hoặc 2 giọt dịch não tủy lên một lam kính tráng cồn để tạo thành một giọt lớn, không dàn tiêu bản.
- Để lam kính khô tự nhiên trong tủ an toàn sinh học hoặc phủ lên trên bằng một lam kính ấm hơn.
- Cố định tiêu bản bằng methanol.
- Nhuộm Gram. Trả lời kết quả nhuộm Gram dịch não tủy ngay lập tức. Sự có mặt của bất kỳ loại vi khuẩn nào đều có ý nghĩa. Tuy nhiên, trong trường hợp số lượng vi sinh vật rất ít, chỉ quan sát được trên 1 hoặc 2 vi trường, nên làm thêm một tiêu bản thứ 2 để khẳng định.
3.3. Nuôi cấy và phân lập
3.3.1. Môi trường
- Thạch máu (BAP)
- Thạch Socola (CHOC)
- Thạch Mac Conkey (MAC)
- Canh thang BHI để tăng sinh cả vi khuẩn hiếu khí và yếm khí khó mọc.
3.3.2. Nuôi cấy
- Sử dụng một pipet vô trùng, hút dịch từ đáy ống bệnh phẩm.
- Nhỏ 2 hoặc 3 giọt vào BAP, CHOC, và MAC. Ria phân 4 vùng bằng cách sử dụng que cấy riêng biệt hoặc đốt que cấy để cấy từng loại môi trường.
- Nếu khối lượng dịch não tủy lớn hơn 1 ml, cấy 1 ml vào canh thang.
o Bệnh phẩm của khoa cấp cứu thường là viêm màng não mắc phải từ cộng đồng.
o Bệnh phẩm của khoa thần kinh chắc chắn có mặt của vi khuẩn kỵ khí nên cần cấy thêm canh thang.
o Nếu dịch não tủy với khối lượng lớn, thường từ ống dẫn lưu hoặc túi chứa dịch.
- Nếu bệnh phẩm chỉ là 1 - 5 giọt, tiến hành như sau.
o Nếu 1 giọt: sử dụng một pipet Pasteur vô trùng và chuẩn bị nhuộm
o Sử dụng một pipet Pasteur vô trùng, nhỏ khoảng 0,5 ml canh thang vào ống bệnh phẩm. Đậy nắp ống, và lắc ống để trộn bệnh phẩm.
o Sử dụng canh thang đã trộn bệnh phẩm để cấy lên môi trường và nhuộm Gram.
o Lưu ý: Thông báo về khối lượng bệnh phẩm đã nhận được.
3.3.3. Lưu giữ bệnh phẩm dịch não tủy
Lưu giữ một số dịch não tủy tại 4oC và/ hoặc ở 20oC trong 1 tuần cho PCR hoặc các yêu cầu tiếp theo.
3.3.4. Ủ ấm
- Ủ ấm đĩa thạch ở 35 - 37oC có 5% CO2.
- Ủ ấm canh thang ở 35 - 37oC trong khí trường bình thường.
3.4. Định danh
3.4.1. Kiểm tra đĩa nuôi cấy
Quan sát bằng mắt thường sự phát triển của vi sinh vật sau 24 tiếng trên tất cả các đĩa và canh thang.
Nếu không thấy vi sinh vật phát triển, tiếp tục ủ ấm.
- Quan sát đĩa môi trường hang ngày trong 4 ngày.
- Nếu nhuộm Gram có vi sinh vật nhưng không thấy mọc hoặc yêu cầu cấy nấm, giữ tất cả các đĩa ít nhất 1 tuần.
- Kiểm tra canh thang hàng ngày trong 4 ngày và giữ đến 7 ngày trước khi bỏ.
Nếu thấy vi sinh vật phát triển:
- Thông báo ngay cho bác sĩ về phát hiện nuôi cấy dương tính.
3.4.2. Định danh
Định danh tất cả các vi sinh vật. Xác định chi và loài của các tác nhân gây ở bệnh dịch não tủy trong vòng 2 giờ sau khi quan sát thấy khuẩn lạc.
3.4.3. Kháng sinh đồ
- Tiến hành kháng sinh đồ đối với vi khuẩn gram-âm đường ruột và vi khuẩn gram-âm không lên men đường, Enterococci, S. pneumoniae, Staphylococcus aureus, và Staphylococci gây bệnh.
a. Đối với H. influenzae, tiến hành thử nghiệm beta-lactamase. Tiến hành kháng sinh đồ với penicillin hoặc ampicillin nếu thử nghiệm beta-lactamase âm tính và một trong hai kháng sinh này sẽ được sử dụng để điều trị.
b. Đối với Listeria, Streptococcus agalactiae, và N. meningitidis, không tiến hành kháng sinh đồ hoặc thử nghiệm beta-lactamase, vì có thể dẫn đến kết quả sai. Các vi khuẩn này rất hiếm khi đề kháng với penicillin; để khẳng định các chủng không nhạy cảm penicillin cần gửi đến phòng xét nghiệm tham chiếu (3). Đối với các bệnh nhân dị ứng penicillin, tham khảo ý kiến bác sĩ để hướng dẫn kháng sinh đồ.
- Không tiến hành định danh đầy đủ hoặc kháng sinh đồ (AST) nếu nghi ngờ nhiễm bẩn hoặc tụ cầu coagulase-âm (CoNS) phân lập chỉ từ canh thang. Chú ý: Phân lập CoNS và Corynebacterium có thể nhiễm bẩn do nhiễm trùng mắc phải ở cộng đồng, nhưng có thể hoặc không thể là một nguyên nhân gây ra nhiễm trùng trong các bệnh nhiễm trùng do đặt ống dẫn lưu và người bệnh chấn thương đầu. Một vài khuẩn lạc của trực khuẩn gram-dương có catalase-dương, chỉ mọc trên CHOC cần cấy truyền sang BAP để kiểm tra tan máu và loại trừ vi khuẩn Listeria trước khi báo cáo là Corynebacteria.
3.4.4. Lưu giữ đĩa nuôi cấy dương tính
Giữ các đĩa nuôi cấy dương tính ít nhất 7 ngày, hoặc tốt hơn, giữ lâu dài các chủng phân lập được trong tủ lạnh âm sâu.
3.5. Báo cáo kết quả
- Báo cáo kết quả nhuộm Gram càng sớm càng tốt, thường là trong vòng 1 tiếng sau khi nhận bệnh phẩm.
- Báo cáo sơ bộ chi và loài càng sớm càng tốt trong khi tiếp tục tiến hành các thử nghiệm tiếp theo
- Trả kết quả khẳng định tác nhân gây bệnh cho bác sỹ điều trị.
3.6. Diễn giải kết quả
- Chỉ ra tác nhân vi sinh vật nuôi cấy dương tính
- Không thấy bạch cầu đa nhân trung tính trong dịch não tủy không loại trừ nhiễm trùng, đặc biệt là nhiễm Listeria.
- Nguyên nhân phổ biến nhất của viêm màng não do vi khuẩn mắc phải ở cộng đồng là S. pneumoniae.
- Phân lập được Enterococci trong dịch não tủy có thể là dấu hiệu nhiễm giun lươn.
3.7. Hạn chế
a. Dương tính giả: Do nhiễm bẩn hoặc vi khuẩn cư trú ở da.
b. Âm tính giả: Vi khuẩn có trong bệnh phẩm với số lượng ít, bệnh nhân đã điều trị kháng sinh từ trước hoặc vi sinh vật khó nuôi cấy.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Connie R. Mahon, Donald C. Lehman, Geogrge Manuselis (2007), “Textbook of diagnostic Microbiology”, Third edition.
2. Cedric A Mims (1993), "Medical microbiology", Mosby - Year Book Europe Limited.
3. Ellen Jo Baron, Sydney M. Finegold (1990), "Bailey & Scott’s Diagnostic microbiology", Eighth edition. The C. V. Mosby Company.
4. J. Vandepitte, J. Verhaegen, K. Engbaek (2003), “Basic laboratory procedures in clinical bacteriology”, Second edition, World Health Organization - Geneva.
5. James G. Cappuccino Natalie Sherman (2001), “Medical Microbiology a Laboratory manual”. New York. USA.
6. Koneman EW (1992), "Color atlas and textbook of diagnostic microbiology", Four edition.
7. Lynn S. Garcia, Henry D. Isenberg (2010), “Clinical microbiology procedures handbook” Third edition and 2007 update. ASM press. Washington DC.