+- Diễn đàn xét nghiệm đa khoa (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan)
+-- Diễn đàn: ...:::THẢO LUẬN CHUYÊN NGÀNH:::... (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-8.html)
+--- Diễn đàn: Vi sinh thực phẩm (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-76.html)
+---- Diễn đàn: Thực hành (https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/forum-122.html)
+---- Chủ đề: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN E.COLI O157 (Tham khảo TCVN 7686:2007) (/thread-118.html)
PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN E.COLI O157 (Tham khảo TCVN 7686:2007) - tuyenlab - 02-18-2012
PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN E.COLI O157
(Tham khảo TCVN 7686:2007)
Các vi sinh vật hình thành các khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch đổ đĩa được sử dụng trong tiêu chuẩn này, có sinh indol và dính kết đặc hiệu với kháng huyết thanh kháng kháng nguyên O157.
2. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này có thể áp dụng sản phẩm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.
3. Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm các sửa đổi
TCVN 6507-1 (ISO 6887-1), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi- chuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật. Phần 1: các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân.
TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi-Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật
4. Thiết bị, dụng cụ, môi trường nuôi cấy, thuốc thử và kháng huyết thanh
4.1 Thiết bị và dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] cụ thể như sau:
- Tủ sấy, nồi hấp áp lực;
- Tủ ấm, nồi cách thủy, máy đo pH;
- Ống nghiệm, bình cầu, ống đong, pipet chia độ xả hết, đĩa petri, que cấy…;
- Thiết bị tách bằng từ tính có giá đỡ từ;
- Các hạt từ tính miễn dịch kháng Escherichia coli O157;
- Ống nghiệm bằng chất dẻo kiểu Eppendorf;
- Bộ trộn quay: có khả năng quay với tốc độ 15 vòng/phút đến 20 vòng/phút;
- Máy trộn vortex.
4.2 Môi trường nuôi cấy và thuốc thử
- Canh thang đậu tương trypton cải biến có novobioxin (mTSB + N);
- Thạch Macconkey sorbitol telurit xefixim (CT-SMAC);
- Thạch EMB hoặc thạch Endo;
- Thạch dinh dưỡng;
- Môi trường trypton/tryptophan;
- Thuốc thử Kovac;
- Dung dịch muối 8,5%;
- Dung dịch đệm phosphat cải biến 0,01 mol/l, pH 7,2.
4.3. Kháng huyết thanh Escherichia coli O157
5. Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử theo các tiêu chuẩn cụ thể thích hợp với sản phẩm có liên quan. Nếu không có các tiêu chuẩn cụ thể riêng liên quan đến việc lấy mẫu sản phẩm thì các bên liên quan nên thỏa thuận.
6. Cách tiến hành
6.1 . Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu
Để chuẩn bị huyền phù ban đầu, cho x g hoặc x ml phần mẫu thử vào 9x ml hoặc 9x g canh thang trypton cải biến có novobioxin (mTSB + N) (4.2), đã được làm ấm sơ bộ trong tủ ấm ở 41,5oC để thu được tỷ lệ của phần mẫu thử và mTSB + N là 1/10 (khối lượng/thể tích hoặc thể tích/thể tích).
6.2 . Tăng sinh
Ủ huyền phù ban đầu đã chuẩn bị theo 6.1 ở 41,5C/6 giờ, rồi ủ tiếp ở 12 giờ đến 18 giờ
Việc tách từ miễn dịch và cấy lên đĩa thạch chọn lọc sau khi ủ 6 giờ có thể cho các kết quả dương tính giả, sau khi ủ tiêp 18 giờ có thể trở thành âm tính.
6.3 Tách bằng từ miễn dịch (IMS)
6.3.1 Khái quát
Sau khi ủ từ 12 giờ đến 18 giờ thì cứ sau 6 giờ có thể tiến hành IMS, nếu cần.
Các chỉ dẫn dưới đây là để hướng dẫn chung, vì vậy cần kết hợp với các hướng dẫn của nhà sản xuất liên quan đến cách tiến hành và phương pháp sử dụng các bộ bắt giữ miễn dịch và thiết bị cần thiết.
6.3.2.Bắt giữ miễn dịch
Việc sử dụng thiết bị tách bằng từ tính và các hạt từ miễn dịch được phủ kháng thể, cần thực hiện quy trình bắt giữ/tách dưới đây:
Trộn dịch cấy tăng sinh và để yên cho nguyên liệu thô lắng xuống. Cho 20µl các hạt từ miễn dịch đã được chuẩn bị ở nhiệt độ phòng vào ống nghiệm Eppendorf. Lấy 1 ml dịch lỏng ở phía trên dịch cấy tăng sinh, nếu có thể, tránh hết các hạt thực phẩm hoặc chất béo, cho vào ống nghiệm Eppendorf.
Trộn huyền phù trên máy trộn quay với tốc độ khoảng từ 12 vòng/phút đến 20 vòng/phút trong 10 phút.
Chú ý: Sử dụng kỹ thuật vô trùng để tránh mọi nhiễm bẩn từ bên ngoài và việc tạo bọt khí. Thực hiện trong tủ an toàn và mang găng tay bảo vệ.
6.3.3.Tách
Đặt từng ống Eppendorf vào giá từ và để cho các hạt từ dính kết dựa vào nam châm bằng cách dịch chuyển nhẹ nhàng giá từ qua lại 180o. Mở nắp cẩn thận mà không làm nhiễu loạn các hạt trên thành ống. Dùng pipet Pasteur vô trùng mới cho mỗi mẫu và mỗi ống nghiệm trong giá từ, loại bỏ dung dịch bằng cách hút từ từ dịch lỏng từ dưới đáy ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch đệm rửa vô trùng và đậy nắp. Lấy nam châm ra khỏi giá. Trộn phần chứa trong ống bằng cách đảo nhẹ nhàng giá qua lại 180o và đặt nam châm trở lại giá.
Chú ý: tránh làm nhiễm bẩn chéo khi bổ sung dung dịch đệm mới.
Tiến hành như trên, sử dụng pipet Pasteur vô trùng mới cho mỗi mẫu để loại bỏ dịch rửa. Lặp lại quy trình rửa vài lần
Lấy ống nghiệm ra khỏi thiết bị từ tính, cho 100 µl dung dịch đệm rửa vô trùng vào ống nghiệm và hòa lại các hạt từ tính.
Chú ý: quy trình này có thể gặp phải khó khăn đối với các sản phẩm chất béo hoặc phomat tươi.
6.4. Cấy lên đĩa thạch chọn lọc và nhận dạng các khuẩn lạc E.coli O157
6.4.1. Cấy lên đĩa
Sử dụng pipet man, hút 50 µl các hạt từ tính đã hòa lại và đã rửa vào đĩa thạch Macconkey sorbitol telurit xefixim đã làm khô và 50 µl vào đĩa môi trường phân lập thứ hai (do phòng thử nghiệm chọn).
Dùng que cấy vòng vô trùng ria cấy các hạt này để thu được nhiều khuẩn lạc tách biệt rõ trên khắp đĩa thạch.
Ủ môi trường nuôi cấy ở 37oC/18-24 giờ và ủ môi trường nuôi cấy chọn lọc thứ hai ở nhiệt độ và thời gian theo quy định.
6.4.2 Nhận dạng các khuẩn lạc E.coli O157 điển hình
Trên đĩa thạch CT-SMAC: khuẩn lạc điển hình là những khuẩn lạc có đường kính xấp xỉ 1mm, trong suốt, gần như không màu và viền ngoài có màu vàng nâu nhạt.
Trên đĩa thạch phân lập chọn lọc thứ hai: đặc điểm khuẩn lạc theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
6.5. Khẳng định
6.5.1 Chọn khuẩn lạc
Lấy 5 khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa, nếu như trên mỗi đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc thì lấy tất cả số khuẩn lạc có mặt để kiểm tra.
Cấy ria từng khuẩn lạc đã chọn lên đĩa thạch dinh dưỡng. Ủ môi trường nuôi cấy ở 37oC/18-24 giờ trong tủ ấm.
6.5.2 Khẳng định bằng tính chất sinh vật hóa học: khả năng sinh indol
Chọn một khuẩn lạc thuần khiết trên đĩa thạch dinh dưỡng cấy vào ống đựng môi trường trypton/tryptophan
Ủ môi trường nuôi cấy ở 37oC/24 giờ trong tủ ấm.
Nhỏ khoảng 1ml thuốc thử Kovac và để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Kết quả: Xuất hiện vòng màu đỏ trong ống môi trường nuôi cấy chứng tỏ phản ứng dương tính, màu vàng/nâu chứng tỏ phản ứng âm tính.
6.5.3 Khẳng định bằng huyết thanh
Chỉ kiểm tra các khuẩn lạc dương tính với indol bằng phản ứng huyết thanh của chúng với kháng huyết thanh O157
6.5.3.1. Loại bỏ các vi khuẩn phân lập tự kết dính
Cho 1 giọt nước NaCl 8,5% lên một lam kính sạch.
Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ đĩa thạch dinh dưỡng, nghiền vi khuẩn trong giọt nước NaCl 8,5% sao cho thu được huyền phù đục và đồng nhất.
Di chuyển phiến kính nhẹ nhàng trong 30 giây đến 60 giây. Quan sát kết quả thu được dựa vào nền màu đen và dùng kính lúp, nếu cần.
Kết quả: nếu huyền phù tạo thành các mảng có thể nhìn thấy, thì chủng đó được coi là tự kết dính và không được dùng để kiểm tra tiếp.
6.5.3.2. Phản ứng kháng huyết thanh E.coli O157
Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ đĩa thạch dinh dưỡng, nghiền vi khuẩn trong giọt nước NaCl 8,5% sao cho thu được huyền phù đục và đồng nhất. Thêm một giọt kháng huyết thanh E.coli O157, trộn đều.
Kết quả: nếu trong vòng 1 phút, thấy xuất hiện hiện tượng dính kết thì có nghĩa là phản ứng dương tính, nếu không dính kết thì phản ứng âm tính.
6.5.3.3. Nhận dạng dương tính
Các vi khuẩn cho phản ứng dương tính với indol và với kháng huyết thanh O157 hoặc O157 cộng với kháng huyết thanh H7 được coi là các vi khuẩn dương tính.
6.6. Đặc trưng khác
Để nhận dạng các khuẩn lạc dương tính cho việc phát hiện các kháng nguyên roi và các đặc tính gây bệnh, cần gửi các chủng này tới phòng thử nghiệm chuẩn.
7. Đảm bảo chất lượng
7.1 Kiểm tra các chủng về mục đích đảm bảo chất lượng
Các chủng E.coli O157 không mang các yếu tố độc thuộc loại gây bệnh đều có sẵn từ cơ quan lưu giữ vi khuẩn quốc tế hoặc quốc gia. Các chủng này được dùng để kiểm tra về đảm bảo chất lượng môi trường và kháng huyết thanh.
7.2. Phương pháp cấy
Để kiểm tra khả năng của phòng thử nghiệm và môi trường để phát hiện số lượng nhỏ E.coli O157 trong các mẫu thực phẩm cần thử nghiệm bằng phương pháp mô tả trong tiêu chuẩn này, thì các mẫu đối chứng có lượng nhỏ dịch cấy E.coli O157 không gây bệnh và lượng lớn dịch cấy của chủng E.coli khác cần được thực hiện song song với mẫu thử
8. Biểu thị kết quả
Theo phần diễn giải các kết quả, ghi lại sự có mặt hay không có mặt Escherichia coli O157 trong phần mẫu thử, tính theo gam hoặc theo mililit.
9. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
- Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
- Nhiệt độ ủ đã sử dụng;
- Mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;
- Các kết quả thử nghiệm thu được.
Báo cáo kết quả cũng phải nêu rõ nếu các phép thử tiếp theo được thực hiện bởi phòng thử nghiệm chuẩn, hoặc nếu đã thực hiện thì nêu kết quả thu được.
Một số môi trường nuôi cấy
1.1. Môi trường cơ bản
Thành phần
Dịch thủy phân casein bằng enzym 17,0 g
Dịch thủy phân đậu tương bằng enzym 3,0 g
Sorbitol 10,0 g
Muối mật No.3 1,5 g
NaCl 5,0 g
Đỏ trung tính 0,03 g
Tím tinh thể 0,001 g
Thạch 9g đến 1 g
Nước 1000 ml
Pha chế
Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,1 ± 0,2 ở 25oC, nếu cần.
Khử trùng trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121oC/15 phút.
1.2. Dung dịch kali telurit
Thành phần
Kali telurit 0,25 g
Nước 100 ml
Pha chế
Hòa tan kali telurit trong nước và lọc qua màng lọc để khử trùng.
Bảo quản: 1 tháng ở nhiệt độ 5 oC ± 3 oC, khi xuất hiện kết tủa trắng thì loại bỏ.
1.3. Dung dịch xefixim
Thành phần
Xefixim 5,0 mg
Nước 100 ml
Cách pha
Hòa tan xefixim trong nước và lọc qua màng lọc để khử trùng.
Chú ý: Xefixim có thể cần phải hòa tan trong etanol.
Dung dịch này bảo quản được một tuần ở nhiệt độ 3 oC ± 2 oC.
1.4. Môi trường hoàn chỉnh
Thành phần
Môi trường cơ bản 1000 ml
Dung dịch kali telurit 1,0 ml
Dung dịch xefixim 1,0 ml
Pha chế
Làm nguội môi trường cơ bản đã khử trùng đến nhiệt độ khoảng từ 44oC đến 47oC, cho 1 ml dung dịch kali telurit và 1 ml dung dịch xefixim vào 1000 ml môi trường cơ bản.
Nồng độ cuối cùng của kali telurit là 2,5 mg/l và xefixim là 0,05 mg/l.
Bảo quản: môi trường này có thể bảo quản được 2 tuần ở nhiệt độ 3 oC ± 2 oC.
2. Thạch dinh dưỡng
Thành phần
Cao thịt 3,0 g
Pepton 5,0 g
Thạch 9g đến 18g
Nước 1000 ml
Pha chế
Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25oC, nếu cần.
Phân phối môi trường vào các bình có dung tích thích hợp. Khử trùng trong nồi hấp áp lực ở 121oC/15 phút.
Bảo quản: môi trường này có thể bảo quản được 2 tuần ở nhiệt độ 3 oC ± 2 oC.
3. Môi trường trypton/tryptophan
Thành phần
Sản phẩm thủy phân casein bằng emym 10 g
DL-Tryptophan 1 g
NaCl 10 g
Nước 1000 ml
Pha chế
Hòa tan các thành phần này trong nước, đun nóng nếu cần và lọc. Chuyển các lượng môi trường 5 ml vào các ống nghiệm. Khử trùng 121oC/15 phút
4. Canh thang đậu tương trypton cải biến có novobioxin (mTSB+N)
4.1 Canh thang đậu tương trypton cải biến
Thành phần
Dịch thủy phân casein bằng enzym 17 g
Dịch thủy phân đậu tương bằng enzym 3 g
D(+)-glucose 2,5 g
Muối mật No.3 1,5 g
NaCl 5,0 g
K2HPO4 4,0 g
Nước 1000 ml
Pha chế
Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH= 7,4 ± 0,2 ở 25oC, nếu cần.
Phân phối môi trường vào các bình có dung tích thích hợp. Khử trùng trong nồi háp áp lực ở 121oC/15 phút.
4.2 Dung dịch novobioxin
Thành phần
Novobioxin 0,45 g
Nước 100 ml
Pha chế
Hòa tan novobioxin trong nước và lọc qua màng lọc để khử trùng.
Chuẩn bị ngay trong ngày sử dụng.
4.3. Môi trường hoàn chỉnh
Ngay trước khi sử dụng, cho 1ml hoặc 4 ml dung dịc novobioxin vào 225 hoặc 900 ml môi trường mTSB đã nguội.
Nồng độ cuối cùng của mTSB là 20mg/l.
5. Thuốc thử kovacs
Thành phần :
4-dimethylaminbenzaldehyd 5g
2-metylbutan-1-ol hoặc pentan 75ml
Acid clohydric (p20 1.18 đến 1.19 g/ml 25ml
Pha chế :
Hòa tan 4-dêmthylaminbenzaldehyd trong cồn bắng cách đun nóng nhẹ trong nồi cách thủy duy trì ở nhiệt độ 50-550C , làm nguội và thêm acid.
Bảo quản : tránh ánh sáng , ở nhiệt độ 40C.
Thuốc thử phải có màu vàng nhạt hoăc nâu nhạt.
6. Dung dịc đệm rửa: duung dịch đệm phosphat cải biến 0,01mol/l, pH 7,2
Thành phần
NaCl 8 g
KCl 0,2 g
Na2HPO4 (khan) 1,44 g
KH2PO4 (khan) 0,24 g
Polyoxyetylen sorbitan monolaurat 0,2 ml
Nước 1000 ml
Pha chế
Hòa tan các thành phần trong nước. Chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2 ở 25oC, nếu cần.
Phân phối môi trường vào các bình cầu có dung tích thích hợp Khử trùng trong nồi háp áp lực ở 121oC/15 phút.