Diễn đàn xét nghiệm đa khoa - Thực hành

Pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Mon, 23 May 2022 15:22:19 +0000

Dạ chào quý anh chị
Em có một vấn đề nhờ anh chị giải đáp giúp
Khi mình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật, nếu thực hiện trên một bàn sạch, có đèn cồn và thực hiện trong tủ ATSH cấp 2 thì bên nào tốt hơn ạ? Vì theo em nghĩ với tủ ATSH thì mục đích chính là để bảo vệ người thao tác khi làm việc với các mẫu lây nhiễm. Việc tạo ra luồng khí trong tủ (theo lý thuyết là khí sạch) vì vẫn có khả năng làm nhiễm cho đĩa môi trường pha chế hơn là bầu không khí tĩnh khi mình pha chế trên một bàn sạch,...
Xin ý kiến của anh chị ạ

[SOP] Neisseria gonorrhoreae Real-time PCR

Sun, 23 Aug 2020 03:29:52 +0000

Neisseria gonorrhoreae Real-time PCR

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích:

Xác định sự có mặt của Neisseria gonorrhoeae trong bệnh phẩm dịch niệu đạo, cổ tử cung hoặc dịch cơ thể có nghi ngờ có căn nguyên N. gonorrhoeae.

2. Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

- Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

2.1. Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Máy nhiệt

- Máy ly tâm > 12000 gpm/phút

- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml

- Máy vortex

- Máy Real-time PCR

- Ống Eppendorf 1,5 ml ho c 2 ml

- Các loại Micropipette đi u chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl

- Đầu côn có màng lọc 10 μl, 100 μl, 200 μl và 1000 μl

- Tủ lạnh thường

- Tủ âm sâu (-20oC) hoặc (-70oC) (nếu có)

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Dụng cụ lấy bệnh phẩm

Khay đựng bệnh phẩm

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Găng không có bột (DNase-RNase free)

Ống nhựa Ependoff 1.5ml

Sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chẩn đoán

Khấu hao sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng

Hóa chất và vật tư tiêu hao cho tách acid nucleic

Tube eppendorff 1,5 ml

Strip 8 tubes 0,1 ml

Nắp đậy strip 8 tubes

Đầu côn có phin lọc 1 ml

Đầu côn có phin lọc 200 ul

Đầu côn có phin lọc 10 ul

Giấy thấm không bụi

Giấy xét nghiệm

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Bút viết kính

Bút bi

Mũ

Khẩu trang

Găng tay xử lý dụng cụ

Quần áo bảo hộ

Dung dịch xà phòng rửa tay

Cồn sát trùng tay nhanh

Dung dịch khử trùng

Khăn lau tay

Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*

* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

Dịch niệu đạo, cổ tử cung ho c dịch cơ thể có nghi ngờ có căn nguyên N.gonorrhoeae.

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.

1. Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem phụ lục).

2. Tiến hành kỹ thuật: VD bộ sinh phẩm chẩn đoán LightPower CHT/NGN rPCR Plus (hoặc sinh phẩm tương đương)

2.1 Tách chiết DNA theo hướng dẫn sử dụng của Kit tách chiết DNA.

2.2 Thực hiện phản ứng Real-time PCR.

2.3 Đọc kết quả

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Bước 1: Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm

- Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu không bị ngoại nhiễm. Vì vậy có thể đọc kết quả mẫu chứng (+) và mẫu.

- Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu bị ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết DNA lại.

Bước 2: Kiểm tra độ nhạy

- Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu HEX: PCR không bị ức chế.

- Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại ho c tín hiệu thấp với kênh màu HEX, PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, tách chiết DNA lại hoặc pha loãng DNA trước khi chạy PCR.

Bước 3: Xác định mẫu dương tính Neisseria gonorrhoeae

- Chọn từng mẫu , chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM

- Mẫu có tín hiệu huỳnh quang với kênh màu FAM và có Ct: là những mẫu dương tính Neisseria gonorrhoeae

- Các mẫu có Ct <12 và tín hiệu huỳnh quang không tăng theo chu kỳ nhiệt: pha loãng DNA mẫu với tỉ lệ 1/5 trước khi cho vào PCR master mix

Bước 4: Xác định mẫu âm tính Neisseria gonorrhoeae

- Chọn từng mẫu, chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Mẫu không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và dương tính với màu HEX, thì kết quả là mẫu âm tính với Neisseria gonorrhoeae

- Nếu mẫu có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM nhưng không có Ct và dương tính với màu HEX, thì kết quả là Neisseria gonorrhoeae trong bệnh phẩm dưới ngưỡng phát hiện

- Nếu mẫu không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và âm tính với màu HEX, thì mẫu bị ức chế cần tiến hành lại PCR với DNA đã pha loãng hoặc tách chiết lại. Nếu kết quả vẫn như cũ thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm.

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Phản ứng dương tính giả: do tạp nhiễm từ môi trường

- Phản ứng âm tính giả: do phản ứng PCR bị ức chế

- Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân thủ chặt chẽ quy trình kỹ thuật.

Nguồn: Quyết định số: 6769/QĐ-BYT - Về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh

[SOP] Vibrio cholerae real-time PCR

Sat, 15 Aug 2020 03:25:04 +0000

Vibrio cholerae real-time PCR

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Xác định sự có mặt gen đặc trưng của Vibrio cholerae trong mẫu bệnh phẩm phân của người.

2.Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật Real-time PCR.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

2.1 Trang thiết bị

- Tủ an toàn Sinh học cấp 2

- Máy Real-time PCR

- Máy in màu

- Máy ly tâm > 12000 gpm/phút

- Máy nhiệt

- Máy vortex

- Pipette

2.2 Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Lọ lấy bệnh phẩm

Panh

Khay đựng bệnh phẩm

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Tube đựng bệnh phẩm

Găng không có bột (DNase-RNase free)

Sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chẩn đoán

Khấu hao sinh phẩm cho chẩn đoán và kiểm tra chất lượng

Kit tách chiết DNA

Ống Eppendorf 1,5 ml

Ống Eppendorf 0,2 ml

Đầu côn 10 ul có lọc

Đầu côn 30 ul

Đầu côn 200 ul có lọc

Đầu côn 1 ml có lọc

Ethanol BDH

Water-DEPC Treated

Giấy thấm

Giấy xét nghiệm

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Bút viết kính

Bút bi

Mũ

Khẩu trang

Găng tay

Găng tay xử lý dụng cụ

Quần áo

Dung dịch xà phòng rửa tay

Cồn sát trùng tay nhanh

Dung dịch khử trùng

Khăn lau tay

Ngoại kiểm (nếu có)*

3 Bệnh phẩm

Bệnh phẩm phân

4 Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1 Tách chiết DNA tổng số

2.2 Thực hiện Real-time PCR

2.3 Phân tích và đánh giá kết quả

2.4 In và trả kết quả

3. Thời gian thực hiện: 4 tiếng

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Chứng dương phải xuất hiện đồ thị huỳnh quang trên đường giới hạn cơ bản, chứng âm không có bất kỳ đường đồ thị huỳnh quang nào xuất hiện.

Đường đồ thị huỳnh quang của mẫu có thể xuất hiện hoặc không xuất hiện trên đường giới hạn cơ bản, căn cứ vào đó để kết luận kết quả.

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Trong trường hợp positive control (PC) và negative (NC) xuất hiện không đúng với diễn giải phần IV thì phải kiểm tra lại Master mix , chứng dương và quá trình tách DNA tổng số, và thực hiện lại toàn bộ xét nghiệm.

- Nếu đường đồ thị huỳnh quang c a mẫu xuất hiện ngoài chu kỳ thứ 40 thì phải cẩn thận kiểm tra và đánh giá lại mẫu.

Nguồn: Quyết định số: 6769/QĐ-BYT - Về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh

[SOP] Vibrio cholerae soi tươi

Sat, 15 Aug 2020 03:15:54 +0000

Vibrio cholerae soi tươi

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Nhận định đặc điểm di động đặc trưng của V. cholerae trong bệnh phẩm phân hoặc từ huyền dịch vi khuẩn.

2. Nguyên lý

Tính chất di động nhanh như tên bắn là đặc điểm đặc trưng của V. cholerae. Dựa vào đặc điểm di động này để có thể nhận định sơ bộ sự có m t cả V. cholerae trong phân hoặc trong huyền dịch vi khuẩn.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

- Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Nhân viên có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

2.1. Trang thiết bị

Kính hiển vi quang học

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Lọ lấy bệnh phẩm

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Lam kính

Nước muối sinh lý

Cồn 96o lau kính

Lamen

Que cấy

Bôcan

Dung dịch khử khuẩn

Cồn 90o (vệ sinh dụng cụ)

Đèn cồn

Panh

Khay đựng bệnh phẩm

Mũ

Khẩu trang

Găng tay

Găng tay xử lý dụng cụ

Quần áo

A xít ngâm lam

Ống nghiệm thủy tinh

Bút viết kính

Bút bi

Bật lửa

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Cồn sát trùng tay nhanh

Dung dịch xà phòng rửa tay

Khăn lau tay

Giấy trả kết quả xét nghiệm

3. Bệnh phẩm

Phân lỏng.

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.

1. Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

2. Tiến hành kỹ thuật

- Chuẩn bị một lam kính sạch, lấy một hoặc vài loop dịch nuôi cấy hoặc phân lỏng chuyển vào giữa lam kính.

- Đậy lamen lên trên huyền dịch vi khuẩn hoặc giọt phân lỏng trên lam kính.

- Soi vật kính x10 và x40 để quan sát sự di động của vi khuẩn.

- Vứt bỏ lam soi vào bình chứa dung dịch sát khuẩn.

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Trực khuẩn di động như tên bắn là kết quả nghi ngờ sự có mặt của V. cholerae.

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

[b]Nguồn: Quyết định số: 6769/QĐ-BYT - Về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh[/b]

[SOP] NTM (Nontuberculous mycobacteria) định danh Real-time PCR

Fri, 14 Aug 2020 09:33:54 +0000

NTM (Nontuberculous mycobacteria) định danh Real-time PCR

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Xác định DNA đặc trưng của NTM (Nontuberculous mycobacteria) trong mẫu bệnh phẩm của người.

2. Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

2.1. Trang thiết bị

- Máy real-time PCR đa màu và hệ thống máy vi tính.

- Bộ lưu điện

- Máy nhiệt

- Máy ly tâm > 12000 gpm/phút

- Máy ly tâm lạnh

- Tủ lạnh 2oC -8oC

- Tủ âm sâu (-20o C) ho c (-70oC) (nếu có)

- Máy vortex

- T an toàn sinh học

- Micropipettes các thể tích từ 5 µl - 1000 µl.

- Đầu côn có phin lọc các thể tích từ 5 µl - 1000 µl.

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Lọ đựng bệnh phẩm vô trùng

Khay đựng bệnh phẩm

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Găng không có bột tal (DNase-RNase free)

Sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chẩn đoán

Khấu hao sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng

Hóa chất và vật tư tiêu hao cho tách acid nucleic

Tube eppendorff 1,5 ml

Strip 8 tubes 0,1 ml

Nắp đậy strip 8 tubes

Đầu côn có phin lọc 1 ml

Đầu côn có phin lọc 200 µl

Đầu côn có phin lọc 10 µl

Giấy thấm không bụi

Giấy xét nghiệm

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Bút viết kính

Bút bi

Mũ

Khẩu trang

Găng tay xử lý dụng cụ

Quần áo bảo hộ

Dung dịch xà phòng rửa tay

Cồn sát trùng tay nhanh

Dung dịch khử trùng

Khăn lau tay

Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*

* Ghi chú:

- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

Đờm, các dịch sinh học (dịch phế quản, dịch não t y, nước tiểu, phân...), mảnh sinh thiết...

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.

1. Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.

2. Tiến hành kỹ thuật

Các bộ sinh phẩm (VD hoặc tương đương):

- ExiPrep™ Dx Mycobacteria Genomic DNA Kit (Bioneer).

- Accupower MTB & NTM Real-time PCR Kit (Bioneer)

2.1. Thu nhận và xử lí mẫu

Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết DNA (nếu cần).

2.2. Tách chiết DNA, RNA

2.3. Thực hiện phản ứng real-time PCR

Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh

- Cài đặt chương trình cho máy real-time PCR trước khi pha hóa chất.

- Chuẩn bị Master Mix

- Cho chứng +, chứng - hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube Master Mix.

- Cài đặt vị trí mẫu trên phần m m đúng với vị trí mẫu đã đ t trên máy realtime PCR.

- Chọn các kênh màu phù hợp với từng tác nhân của mẫu, chứng dương và chứng âm.

- Lưu file dữ liệu vào máy tính

- Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

1. Điều kiện của phản ứng

- Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang tuyến tính vượt quá tín hiệu nền và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang cho chứng nội dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền (đường biểu diễn âm tính).

- Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang chứng nội dương tính

2. Phân tích mẫu

- Mẫu dương tính: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng tương ứng với màu FAM và máy báo DETECTED.

- Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính và và máy báo NON-DETECTED

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

1. Sự cố: Có mẫu và chứng nội cũng đ u âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

2. Nguyên nhân: Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.

3. Khắc phục: Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.

Nguồn: Quyết định số: 6769/QĐ-BYT - Về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh

[SOP] MTB IGRA (Interferon γ Assay)

Fri, 14 Aug 2020 09:19:00 +0000

MTB IGRA (Interferon γ Assay)

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Xét nghiệm hỗ trợ phát hiện nhiễm M. tuberculosis thông qua việc phát hiện interferon γ (IFN-γ) bằng kỹ thuật ELISA.

2. Nguyên lý

Phát hiện interferon γ do các tế bào miễn dịch tạo ra khi bị kích thích bởi các mycobacterial peptides (ESAT-6, CFP-10 và TB7.7(p4)) dựa trên nguyên lý của kỹ thuật ELISA.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện:

- Người thực hiện: Người thực hiện đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành xét nghiệm.

- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành xét nghiệm.

2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

2.1. Trang thiết bị

- Tủ ấm thường

- Dàn máy ELISA

- Máy ly tâm thường

- Máy lắc phiến nhựa

- Máy Vortex

- Máy đọc phiến nhựa bước sóng 450 nm và 620 – 650 nm

- Tủ lạnh 2oC - 8oC

- Micropipette đơn kênh thể tích từ 10 µl đến 1000 µl.

- Bộ micropipette 8 kênh thể tích từ 50 µl đến 200 µl

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Bông

Dây garô

Cồn

Bơm kim tiêm

Panh

Khay đựng bệnh phẩm

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Tube đựng bệnh phẩm

Sinh phẩm chẩn đoán

Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm chất lượng

Chứng ngoại kiểm âm (nếu có)

Chứng ngoại kiểm dương (nếu có)

Ngoại kiểm (EQAS) (nếu có)*

Nước cất

Đầu côn 1000 µl

Đầu côn 200 µl

Giấy thấm

Giấy xét nghiệm

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Bút viết kính

Bút bi

Mũ

Khẩu trang

Găng tay

Găng tay xử lý dụng cụ

Quần áo bảo hộ

Dung dịch xà phòng rửa tay

Cồn sát trùng tay nhanh

Dung dịch khử trùng

Khăn lau tay

3. Bệnh phẩm

Máu toàn phần 4 ml lấy vào 4 ống, mỗi ống 1 ml theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.

1. Lấy bệnh phẩm

- Lấy 1mL máu tĩnh mạch vào trong mỗi ống QFT (4 ống).

- Sau khi lấy máu xong, lập tức lắc các ống khoảng 10 lần vừa đ mạnh để đảm bảo toàn bộ bề mặt bên trong của ống được phủ máu (để hòa tan) toàn bộ các kháng nguyên trên thành ống.

- Chuyển các ống tới phòng xét nghiệm nhiệt độ 17 – 27°C.

- Máu phải được ấm nhiệt độ 37°C càng sớm càng tốt (và trong vòng16 giờ sau khi lấy máu)

2. Tiến hành kỹ thuật

Bộ sinh phẩm QuantiFERON®-TB Gold (QFT®) plus (VD hoặc bộ sinh phẩm tương đương)

2.1. Bước 1

- Máu phải được ấm càng sớm càng tốt (trong vòng 16 giờ sau khi lấy máu)

- Ủ ấm các ống vị trí đặt thẳng đứng 37°C trong 16 – 24 giờ.

- Không cần điều kiện độ ẩm/CO2.

2.2. Bước 2

- Ly tâm các tube 2000–3000g (RCF) trong thời gian 15 phút.

2.3. Bước 3

Tách huyết tương

- Các mẫu Huyết tương nên chỉ được thu bằng pipette

- Các mẫu huyết tương có thể được lấy trực tiếp từ các ống QFT đã ly tâm vào các giếng ELISA, bao gồm cả khi sử dụng

dàn ELISA tự động.

- Các mẫu huyết tương đã tách có thể được bảo quản trong 28 ngày nhiệt độ 2–8°C, dưới –20°C trong thời gian dài hơn.

2.4. Bước 4

- Đánh số, sắp xếp bệnh phẩm và viết sơ đồ theo thứ tự.

2.5. Bước 5

- Chuẩn bị hóa chất ELISA

- Hiệu chỉnh Lọ Standard và Conjugate

2.6. Bước 6

- Vẽ sơ đồ thực hiện

2.7. Bước 7

- Chuẩn bị dung dịch Standard và dung dịch Working Strength

2.8. Bước 8

- Chuẩn bị số Trip trên đĩa ELISA đủ cho số lượng mẫu

2.9. Bước 9

- Lấy 50µL dung dịch working strength vao mỗi giếng ELISA

- Lấy 50µL huyết tương vào các giếng ELISA mẫu (trừ các giếng S1,S2,S3,S4)

- Lấy 50µL dung dịch S1, S2, S3, S4 theo thứ tự đã ghi sơ đồ

2.10. Bước 10

Lắc đĩa trong thời gian 1 phút nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ (Cần bọc đia ELISA để

tránh tiếp xúc ánh sáng trực tiếp.

2.11. Bước 11

- Chuẩn bị dịch rửa

2.12. Bước 12

- Hút 100µL dung dịch Substrate vào mỗi giếng

- Phủ kín và nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút

- Cho tiếp 50µL dung dịch stopping solution vào mỗi giếng và lắc

2.13. Bước 13

- Đo OD bước sóng 450nm và tham chiếu bước sóng 620nm trong vòng 5 phút khi dừng phản ứng

2.14. Bước 14

- Sử dụng phần mềm QFT 2.7.1 để phân tích kết quả

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

1. Xác nhận kết quả khi:

- Gía trị trung bình OD cho Standard 1 phải ≥ 0,600

- %CV của các giá trị lặp lại của Standard 1 và Standard 2 phải ≤ 15%

- Các giá trị OD lặp lại c a Standard 3 và Standard 4 phải không sai khác qua 0,040 đơn vị OD so với giá trị trung bình của nó.

- Hệ số tương quan tính từ các giá trị trung bình của các Standards phải ≥0,98.

2. Diễn giải kết quả

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

1. Sai sót

Kết quả không xác định hoặc không tin cậy có thể do:

- Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn.

- Mẫu từ lúc lấy đến lúc được 37ºC lâu hơn 16 tiếng.

- Lượng interferon γ quá nhiều heterophile antibody.

2. Xử trí

- Tuân thủ đúng các bước qui trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm sử dụng.

Nguồn: Quyết định số: 6769/QĐ-BYT - Về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh

[SOP] Vi khuẩn vi hiếu khí nuôi cấy và định danh bằng phương pháp thông thường

Fri, 14 Aug 2020 08:53:01 +0000

Vi khuẩn vi hiếu khí nuôi cấy và định danh bằng phương pháp thông thường

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
1. Mục đích
Phát hiện và định danh vi khuẩn vi hiếu khí gây bệnh bằng phương pháp nuôi cấy kinh điển.

2. Nguyên lý
Dựa vào đặc điểm và hình dạng, tính chất bắt màu của vi khuẩn khi nhuộm Gram, đặc điểm của khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy, điều kiện khí trường cần cho nuôi cấy và các thử nghiệm sinh vật hóa học để xác định vi khuẩn.

II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh

2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương):
2.1 Trang thiết bị:
- Tủ an toàn sinh học cấp 2
- Tủ ấm thường, tủ ấm CO2
- Kính hiển vi
- Lò hấp
- Máy đo độ đục chuẩn
- Máy tính cài phần mềm đọc API (nếu có)
- Hộp nuôi cấy kín

2.2 Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Môi trường vận chuyển bệnh phẩm

Môi trường nuôi cấy vi hiếu khí

Túi Genbag vi hiếu khí

Bộ định danh API

Dung dịch Oxydase

Thuốc nhuộm tím Gentian

Lugol

Cồn tẩy màu 950

Thuốc nhuộm đỏ Fucsin

Dầu soi kính

Cồn 700 lau t an toàn sinh học

Đầu côn 200µl vô trùng

Lam kính

Que cấy nhựa vô trùng

Tube plastic 5 ml vô trùng

Khay đựng bệnh phẩm

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Dung dịch xà phòng rửa tay

A xít ngâm lam

Mũ bảo hộ

Khẩu trang

Găng tay

Giấy lau bề mặt tủ an toàn

Dung dịch khử trùng

Găng xử lý dụng cụ

Bút viết kính

Bút bi

Túi đựng rác

Áo phòng xét nghiệm

Sổ xét nghiệm

Giấy trả kết quả xét nghiệm

Nội kiểm tra chất lượng (QC)* (nếu thực hiện)

Ngoại kiểm tra (EQAS)* (nếu thực hiện)

* Ghi chú:
- Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng > 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).

- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 4 lần/1 năm).

3 Bệnh phẩm
Tất cả bệnh phẩm được chỉ định nuôi cấy tìm vi khuẩn vi hiếu khí.

4 Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.

2. Tiến hành kỹ thuật
- Nhuộm soi bệnh phẩm, đánh giá sơ bộ

- Cấy bệnh phẩm trên môi trường nuôi cấy

- Ủ ấm trong điều kiện khí trường tối ưu phù hợp, nhiệt độ thích hợp và trong thời gian phù hợp với tuỳ loại căn nguyên cần tìm kiếm.

- Lấy khuẩn lạc nghi ngờ nhuộm Gram, thử tính chất sinh vật hóa học đơn giản, định danh bằng bộ API.

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Dựa kết quả nhuộm Gram, đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm sinh vật hóa học của vi khuẩn để nhận định kết quả.

- Dương tính: Phân lập và định danh được vi khuẩn gây bệnh. Trả tên vi khuẩn gây bệnh đến mức độ chi và/hoặc loài.

- Âm tính: Không tìm thấy hoặc không phân lập được vi khuẩn gây bệnh

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Quy trình này chỉ áp dụng cho nuôi cấy và định danh tìm vi khuẩn vi hiếu khí trong các loại bệnh phẩm.

- Kết quả âm tính không có nghĩa là không có vi khuẩn gây bệnh trong bệnh phẩm, mà chỉ khẳng định là không tìm thấy vi khuẩn gây bệnh có thể phân lập được bằng quy trình nuôi cấy này.

- Bệnh phẩm lấy, vận chuyển và bảo quản không đúng yêu cầu có thể đưa đến kết quả âm tính hoặc dương tính giả.

Nguồn: Quyết định số: 6769/QĐ-BYT - Về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh

[SOPs Vi sinh] Kỹ thuật làm tiêu bản

Tue, 07 May 2019 08:55:38 +0000

KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN

1. Mục đích

Quy trình này hướng dẫn cách làm tiêu bản để chuẩn bị cho các phương pháp nhuộm phát hiện hình thể, cách sắp xếp, tính chất bắt màu của vi sinh vật cũng như các thành phần khác trong bệnh phẩm (nếu có).

2. Phạm vi áp dụng

Quy trình này được áp dụng ở Khoa/Phòng/Bộ phận vi sinh của các Bệnh viện.

3. Trách nhiệm

- Người thực hiện: Đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh y học.

- Người nhận định, giám sát và phê duyệt kết quả: Có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh y học.

4. Nguyên tắc: Không áp dụng

5. Trang thiết bị, vật tư

a. Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học (ATSH) cấp 2

- Kính hiển vi quang học.

- Máy ly tâm

- Máy trộn, lắc.

- Ống vô trùng có nắp đậy.

- Đèn cồn, que cấy, lam kính, lá kính mỏng, bút viết kính, dầu soi kính, giấy thấm dầu.

- Pipet Pasteur vô trùng.

b. Sinh phẩm hóa chất

- Bộ thuốc nhuộm: Tùy vào kỹ thuật nhuộm mà sử dụng bộ thuốc nhuộm phù hợp

- Dung dịch nước muối sinh lý vô trùng 0,9%.

6. Kiểm tra chất lượng

- Các hóa chất dùng để nhuộm soi phải được kiểm tra theo Quy trình kiểm tra chất lượng hóa chất và lưu lại kết quả sau khi kiểm tra.

- Cần có Chứng âm, Chứng dương tùy vào mỗi kỹ thuật nhuộm.

7. An toàn

- Thực hiện thao tác với mẫu bệnh phẩm trong tủ ATSH

- Sử dụng các thiết bị bảo hộ cá nhân.

8. Nội dung thực hiện

- Chuẩn bị lam kính sạch, không xước, vỡ, nhúng vào dung dịch ethanol 95%.

- Sử dụng kẹp gắp lam kính, để ráo cồn, hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn.

- Dán nhãn hoặc ghi thông tin mẫu bệnh phẩm.

- Dùng bút viết kính khoanh tròn, đánh dấu vị trí phết bệnh phẩm ở mặt dưới lam kính.

- Dàn tiêu bản theo hình xoáy trôn ốc từ trong ra ngoài hoặc hình zích zắc.

- Đối với bệnh phẩm dịch não tủy, dịch rửa phế quản và các dịch khác:

+ Ly tâm bệnh phẩm 3000 - 4000 rpm trong 10 phút, chắt bỏ nước nổi.

+ Dùng pipet Pasteur nhỏ 1 - 2 giọt bệnh phẩm lên lam kính, không dàn tiêu bản.

- Với bệnh phẩm nước tiểu:

- Lắc đều ống nước tiểu, lấy 10 µl bệnh phẩm phết lên lam kính, không dàn tiêu bản.

- Với bệnh phẩm từ tăm bông (que gòn):

+ Yêu cầu lấy 2 tăm bông (que gòn) riêng.

+ Trường hợp chỉ có một tăm bông (que gòn) bệnh phẩm, rũ tăm bông (que gòn) trong nước muối sinh lý hoặc canh thang vô trùng, lăn tăm bông (que gòn) trên vùng đã đánh dấu trên lam kính.

- Những bệnh phẩm mủ đặc: Làm mỏng tiêu bản bằng một lam kính khác.

+ Đặt một lam kính thứ 2 sạch lên lam kính đã phết tiêu bản.

+ Kéo nhẹ nhàng lam kính thứ hai trên lam kính ban đầu.

+ Nếu tiêu bản chưa đủ mỏng, tiếp tục lặp lại với một lam kính sạch khác.

- Trường hợp ít bệnh phẩm, bệnh phẩm khô: Hòa loãng trong nước muối sinh lý, dàn tiêu bản.

- Bệnh phẩm mô, mảnh sinh thiết: Nghiền, cắt nhỏ bệnh phẩm, dàn tiêu bản.

- Bệnh phẩm từ môi trường nuôi cấy lỏng, nhỏ 1 - 2 giọt lên lam kính, dàn tiêu bản.

- Bệnh phẩm từ khuẩn lạc (khóm): Pha huyền dịch vi khuẩn, dàn tiêu bản.

9. Diễn giải kết quả và báo cáo:

Tùy từng loại đồ phiến cho các phương phá nhuộm khác nhau sẽ có yêu cầu riêng.

10. Lưu ý (cảnh báo)

Tiêu bản không quá dày, không quá mỏng.

11. Lưu trữ hồ sơ

- Ghi chép rõ ràng kết quả và các thông tin quy định vào phiếu trả lời kết quả và sổ kết quả xét nghiệm.

- Lưu trữ các biểu mẫu phiếu kiểm tra chất lượng theo đúng quy định của khoa.

Nguồn: Quyết định số 1539/QĐ-BYT ngày 20/4/2017 của Bộ trưởng Bộ Y tế

Tình huống xét nghiệm DNT

Tue, 22 May 2018 15:20:35 +0000

Xin chào các anh chị và các bạn
Xin anh chị và các bạn cho ý kiến về trường hợp này ạ, có thể chẩn đoán được gì ạ.
Bệnh nhân nữ, nhi sơ sinh, bs chọc dịch não tủy và kq xét nghiệm như sau:
Vi sinh: Dịch mờ, sau ly tâm không có máu
Bạch cầu 410tb/mm3. Lympho 90%, notro 5%.
Nhuộm gram: ko thấy vk
Sinh hóa: glu 2,15mmol/l, protein 1,23mmol/l, phản ứng pandy âm tính

Xét nghiệm sàng lọc liên cầu B ở phụ nữ có thai

Wed, 27 Dec 2017 01:56:27 +0000

Mình muốn hỏi một chút về XÉT NGHIỆM LIÊN CẦU B Ở PHỤ NỮ CÓ THAI:
Nếu sử dụng môi trường chọn lọc liên cầu B ( Chrom ID Strepto B) thì có cần làm CAMP test nữa không. Bạn nào đã và đang thực hiện xét nghiệm này có thể cho mình xin các phương pháp, quy trình xét nghiệm cũng như giá xét nghiệm không. Các bạn có kinh nghiệm gì chia sẻ giúp mình với. Cảm ơn các bạn nhiều!

Cách bảo quản dịch não tủy, dịch màng bụng, dịch màng phổi,...

Fri, 14 Jul 2017 01:13:59 +0000

Kính chào các anh chị
Tôi có một thắc mắc mong các anh chị giải đáp giúp
Để bảo quản các dịch: não tủy, màng phổi, màng tim,... thì có một số tài liệu nói là chỉ được bảo quản trong tủ ấm, không được bảo quản lạnh vì vi khuẩn sẽ chết ở nhiệt độ thấp, một số tài liệu thì nói là bảo quản được trong tủ lạnh từ 2-8 độ C.
Ở bệnh viện tôi thì dịch sẽ làm xét nghiệm tế bào (đếm số lượng tế bào) và cấy. Vậy cách bảo quản 2 xét nghiệm trên có khác nhau không ạ
Xin cảm ơn

CÁCH ĐỌC KẾT QUẢ ĐỊNH DANH VI KHUẨN CỦA MÁY ĐỊNH DANH TỰ ĐỘNG PHEONIX

Wed, 31 May 2017 03:07:25 +0000

Em có gửi nhờ mẫu định danh vi khuẩn bằng máy BD Pheonix và nhận được tờ kết quả nhưng em không phải sinh viên chuyên ngành nên không giải thích được các kí hiệu viết tắt của các phản ứng sinh hóa mà máy sử dụng ạ.
Anh chị có thể giúp em giải thích kí hiệu được không ạ.
Em cảm ơn ạ.

2ht2.pdf (Kích thước: 99.35 KB / Tải về: 354)

soi tươi

Mon, 16 Jan 2017 12:21:27 +0000

Hệ thống dấu cộng về bạch cầu và vi khuẩn trong việc trả kết quả soi tươi là như thế nào ạ?

CHO EM HỎI VỀ PHẢN ỨNG CAMP TEST

Sun, 13 Nov 2016 16:35:57 +0000

MÌnh đang thực hiện chẩn đoán Liên cầu B đối với phụ nữ mang thai( Streptococcus agalactiae). Những chủng liên cầu B mình phân lâp chạy PCR dương tính, tuy nhiên Tiêu chuẩn vàng để định danh Liên cầu B là phản ứng CAMP phải dương tính.
Mình đã thực hiện trên thạch máu thỏ 5% nhiều lần nhưng kết quả không có hình dạng mũi tên như lý thuyết.
B1: Cấy đường cấy S.aureus chính giữa
B2: Cấy vi khuẩn LC B đường vuông góc với S.aureus cách 1mm
B3. Cấy chủng vi khuẩn Liên cầu A vuông góc với đường S.aureus làm chứng âm
Sau đó cho vào tủ ấm 37 độ C khí trường 5-10% CO2.24h đọc kết quả không thấy vùng tan máu hình tam giác(hay hình mũi tên như lý thuyết)??
Vậy cho mình hỏi chuyên gia vi sinh nào đã từng thực hiện CAMP test thì giải thích cho mình với ạ.CÁM ƠN TẤT CẢ.
Mình thay máu thỏ bằng máu cừu vẫn không có hình ảnh vòng tan máu hình mũi tên??
đúng là lý thuyết và thực hành 1 trời 1 vực!!???

http://en.wikipedia.org/wiki/CAMP_test#m...P_test.JPG

Báo cáo thực hành Vi sinh lâm sàng

Thu, 08 Sep 2016 01:15:42 +0000

https://drive.google.com/open?id=0B6q4HT...mNWaVNXclk