Xác định diazepam và các dẫn chất nhóm 1-4 Benzodiazepin trong dịch cơ thể, phủ tạng và tang vật các vụ án bằng phản ứng màu, sắc ký lớp mỏng, quang phổ UV- VIS, sắc ký lỏng cao áp..

- Dụng cụ: bát sứ, đũa thuỷ tinh, Bản mỏng Silicagel G hoặc 60GF254, Bình triển khai sắc ký, đầu côn nhỏ, đầu phun sương, quả bóp, máy sấy, máy đo UV, nồi cách thuỷ.

- Hoá chất: 3,5-P-Dinitrobenzen 1% trong methanol, Kali hydroxyd 30%, Cloroform, Aceton

- Mẫu thử: Dùng cặn chiết môi trường kiềm, pH chiết khoảng 9-10 (Môi trường B)

Cho một ít cặn chiết B vào lỗ khay sứ, thêm 1-2 giọt dung dịch 3,5-P-Dinitrobenzen 1% trong methanol, sau đó thêm 1 giọt dung dịch Kali hydroxyd 30%, xuất hiện màu hồng.

- Pha dung môi khai triển Cloroform-Aceton : 9:1(v/v) hoặc Methanol-Amoniac: 49:1(v/v), lắc đều rồi đổ vào bình triển khai( chú ý đổ 1 lượng không quá 1cm chiều cao trong bình triển khai) đậy nắp lại để dung môi hoà trộn đều trước khi đặt bản sắc ký vào ít nhất 15 phút.

- Dùng đầu côn nhỏ chấm khoảng 15µL mẫu thử lên bản mỏng. Đồng thời chấm mẫu chuẩn đối chiếu cách mẫu thử khoảng 1cm. Chú ý chấm cách mép dưới bản mỏng khoảng 1cm và vết chấm càng gọn càng tốt, vừa chấm vừa sấy khô.

- Đặt bản mỏng vào trong bình triển khai đã có sẵn dung môi ở trên. Chờ dung môi ngấm dần lên tới khi cách mép trên 1cm nhấc bản mỏng ra. Có thể để khô tự nhiên hoặc sấy khô.

- Soi qua đèn tử ngoại để nhận biết sơ bộ.

- Phun thuốc thủ hiện màu: Dragendorff(TT) và làm tăng độ nhạy bằng dung dịch acid sulfuric 10%. Sắc kí đồ phải cho Rf trùng với các chất đối chiếu.

Mẫu thử được đo trong dung dịch acid sulfuric 0,1N, cho các cực đại theo bảng sau:

2. Xác định Gardenal

3. Xác định nhóm Phenothiazin (Clopromazin và promethazin)

Xác định các thuốc trừ sâu nhóm Phosphor hữu cơ ( bao gồm: Methyl parathion (Wofatox), Parathion, DDVP (Dichlovos), Dipterex,...) trong mẫu thử bằng phản ứng màu, phản ứng tạo Indophenol, sắc ký lớp mỏng, quang phổ UV- VIS, sắc ký khí.

- Dụng cụ: Ống nghiệm, bát sứ, đũa thuỷ tinh, Bản mỏng Silicagel G hoặc 60GF254, Bình triển khai sắc ký, đầu côn nhỏ, đầu phun sương, quả bóp, máy sấy, máy đo UV, nồi cách thuỷ.

- Hoá chất: H[sub]2[/sub]SO[sub]4[/sub], kẽm, phenol 1%, amoniac 25% n-hexan, aceton, paladi clorid 0,25% trong HCl 2N.

- Mẫu thử: Mẫu thử được chiết theo quy trình chung bằng Cloroform hoặc Ether . Mẫu thử lấy từ cắn A.

2.2.1.1 Phản ứng với kiềm cho màu vàng chanh, mất màu khi bị acid hóa

Cặn chiết hoặc 5mL nước tiểu hoặc nước rửa dạ dày cho vào một ống nghiệm, thêm dung dịch NaOH tới pH= 9-10, đung cách thủy 30 phút, nếu có màu vàng chanh xuất hiện thì có khả năng có Methyl parathion.

2.2.1.1 Phản ứng tạo Indophenol

Dung dịch màu vàng chanh ở trên, cho thêm H[sub]2[/sub]SO[sub]4[/sub] đặc tới khi hết màu vàng, thêm 1 hạt kẽm và đung cách thủy sôi 15 phút. Gạn lấy nước, bỏ kẽm thừa. Để nguội, thêm 1mL dung dịch phenol 1% trong nước, sau đó thêm từ từ dung dịch amoniac 25% theo thành ống nghiệm. Nếu thấy mặt tiếp giáp giữa 2 lớp chất lỏng có vòng màu xanh thì chứng tỏ có thuốc trừ sâu phospho hữu cơ loại có nhân para nitrophenol. Song song làm một mẫu trắng.

- Pha dung môi khai triển n- hexan: aceton với tỉ lệ tương đương 4:1, lắc đều rồi đổ vào bình triển khai (chú ý đổ 1 lượng không quá 1cm chiều cao trong bình triển khai) đậy nắp lại để dung môi hoà trộn đều trước khi đặt bản sắc ký vào ít nhất 15 phút.

- Dùng đầu côn nhỏ chấm khoảng 15µL mẫu thử lên bản mỏng. Đồng thời chấm mẫu chuẩn đối chiếu cách mẫu thử khoảng 1cm. Chú ý chấm cách mép dưới bản mỏng khoảng 1cm và vết chấm càng gọn càng tốt, vừa chấm ta vừa sấy khô.

- Đặt bản mỏng vào trong bình triển khai đã có sẵn dung môi ở trên. Chờ dung môi ngấm dần lên tới khi cách mép trên 1cm ta nhấc bản mỏng ra. Có thể để khô tự nhiên hoặc sấy khô.

- Soi qua đèn tử ngoại để nhận biết sơ bộ.

- Phun thuốc thủ hiện màu: phun thuốc thử paladi clorid 0,25%, vết chấm có màu hồng và có Rf trùng với mẫu chuẩn.

- Cách 1: Lấy cặn chiết A đem hoà tan vào Methanol (có thể lọc qua giấy lọc) đo quang phổ UV- VIS.

Kết quả: + Methyl parathion cho đỉnh phổ cực đại tại 269nm

+ Parathion cho đỉnh phổ cực đại tại 274nm

+ DDVP cho đỉnh phổ cực đại tại 286nm

+ Dipterex cho 2 đỉnh phổ cực đại tại 232nm và 272nm

- Cách 2: Chạy sắc ký bản mỏng của cặn chiết A sau đó sấy khô, soi đèn tử ngoại dùng bút chì xác định các vết. Cạo các vết này ra hoà tan vào Methanol lọc qua giấy lọc sau đó đo quang phổ UV-VIS. Các đỉnh hấp thụ sẽ tương ứng cho từng chất.

- Mẫu thử phải dương tính với các phương pháp trên mới có thể kết luận.

- Ngoài ra hiện nay để kết quả đạt độ chính xác cao dùng kỹ thuật trên máy sắc ký khí có gắn khối phổ (GC-MS)

- Nếu không đủ các điều kiện thử nghiệm trên phải tiến hành phân tích sắc ký lớp mỏng chạy trên 3 hệ dung môi khác nhau đối chiếu mẫu chuẩn đều cho kết quả tương đương mẫu chuẩn mới được phép kết luận.

Xác định các thuốc trừ sâu nhóm Clo hữu cơ (bao gồm: DDT, BHC (666)...) trong mẫu thử bằng phản ứng cắt Clo hữu cơ, sắc ký lớp mỏng, quang phổ UV- VIS, sắc ký khí...

- Dụng cụ: Bát sứ, đũa thuỷ tinh, Bản mỏng Silicagel G hoặc 60GF254, Bình triển khai sắc ký, đầu côn nhỏ, đầu phun sương, quả bóp, máy sấy, máy đo UV, nồi cách thuỷ.

- Hoá chất: NaOH10%. HNO[sub]3[/sub]10%, bạc nitrat5%, NH[sub]3[/sub]10%, n-hexan, aceton, 1% diphenylamin trong cồn. resorcin 2% trong NaOH 10%

- Mẫu thử: Mẫu thử được chiết theo quy trình chung bằng Cloroform hoặc Ether . Mẫu thử lấy từ cắn A.

2.2.1 Phản ứng cắt Clo hữu cơ.

Lấy 1 phần dịch chiết A bốc hơi trên nồi cách thuỷ, thêm vào 2mL dung dich NaOH 10%, đun cách thuỷ 30 phút. Sau đó acid hoá bằng acid nitric 10% tới dư acid rồi thêm 0,5mL dung dịch bạc nitrat 5% sẽ xuất hiện tủa trứng lổn nhổn. Tủa này không tan trong acid nitric loãng nhưng tan trong dung dịch amoniac 10% thừa

- Pha dung môi khai triển n- hexan: aceton với tỉ lệ tương đương 4:1, lắc đều rồi đổ vào bình triển khai (chú ý đổ 1 lượng không quá 1cm chiều cao trong bình triển khai) đậy nắp lại để dung môi hoà trộn đều trước khi đặt bản sắc ký vào ít nhất 15 phút.

- Dùng đầu côn nhỏ chấm khoảng 15µL mẫu thử lên bản mỏng. Đồng thời chấm mẫu chuẩn đối chiếu cách mẫu thử khoảng 1cm. Chú ý chấm cách mép dưới bản mỏng khoảng 1cm và vết chấm càng gọn càng tốt, vừa chấm vừa sấy khô.

- Đặt bản mỏng vào trong bình triển khai đã có sẵn dung môi ở trên. Chờ dung môi ngấm dần lên tới khi cách mép trên 1 -2 cm nhấc bản mỏng ra. Có thể để khô tự nhiên hoặc sấy khô.

- Soi qua đèn tử ngoại để nhận biết sơ bộ.

- Phun thuốc thủ hiện màu:

+ Với DDT, 666: phun thuốc thử 1% diphenylamin trong cồn, để bản mỏng dưới ánh sáng mặt trời 30 phút, vết chấm có màu xanh lá mạ và có Rf trùng với mẫu chuẩn.

- Cách 1: Lấy cặn chiết A đem hoà tan vào Methanol (có thể lọc qua giấy lọc) đo quang phổ UV- VIS.

Kết quả: + DDT cho 2 đỉnh phổ cực đại tại 236nm và 267nm

+ 666 cho 2 đỉnh phổ cực đại tại 284nm và 292nm

- Cách 2: Chạy sắc ký bản mỏng của cặn chiết A sau đó sấy khô, soi đèn tử ngoại dùng bút chì xác định các vết. Cạo các vết này ra hoà tan vào Methanol lọc qua giấy lọc sau đó đo quang phổ UV-VIS. Các đỉnh hấp thụ sẽ tương ứng cho từng chất.

- Mẫu thử phải dương tính với các phương pháp trên mới có thể kết luận.

- Ngoài ra hiện nay để kết quả đạt độ chính xác cao và xác định được hàm lượng dùng kỹ thuật trên máy sắc ký khí có gắn khối phổ (GC-MS)

- Nếu không đủ các điều kiện thử nghiệm trên thì phải tiến hành phân tích sắc ký lớp mỏng chạy trên 3 hệ dung môi khác nhau đối chiếu mẫu chuẩn đều cho kết quả tương đương mẫu chuẩn mới được phép kết luận.

[table=95]FrohdeMarquiMarquiFeCl3 10%MorphinTímĐỏ tímĐỏXanhCodeinKhông màuĐỏ tímKhông màuKhông màuHeroinTímĐỏ tímVàngKhông màuPapaverinHồngĐỏ hồngNacotinXanh lụcTím

- Năm 1906, nhà bác học Nga Tsvet đã cho dung dịch các sắc tố thực vật (Clorophyl và xanthophyl) trong ête dầu hoả lên cột nhồi bột mịn calci carbonat, ông thấy các sắc tố bị hấp phụ trên đầu cột. Khi cho dung môi nguyên chất (ête dầu hoả) lên cột, các sắc tố di chuyển trong cột từ trên xuống dưới, mỗi sắc tố có một tốc độ riêng, tách thành những vùng hay vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành một hệ mà Tsvet gọi sắc đồ. Ông đặt tên cho phương pháp tách này là sắc ký (chromato-graphy). Trong tiếng Hy lạp chroma là màu graphein là viết. Tên gọi này ngày nay vẫn được sử dụng mặc dù phương pháp được dùng tách các chất không màu.

- Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động (trong thí nghiệm của Tsvet, pha tĩnh là calci carbonat và pha động là dung môi ête dầu hoả).

Quá trình tách sắc ký thường bao gồm 3 giai đoạn chính:

a. Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ đưa các sắc tố lên đầu cột canlci carbonat).

Các chất được giữ trên pha tĩnh.

b. Cho pha động chạy qua pha tĩnh (ví dụ: dung môi ête dầu hoả qua cột),

kéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và có vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc đồ. Giai đoạn này gọi là khai triển sắc ký.

c. Phát hiện các chất: các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không màu có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử. Trong sắc ký rửa giải có thể phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửa giải đi qua một bộ phận phát hiện gọi là detectơ (detector) đặt sau cột.

- Quá trình sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên một lớp bột rải và được giữ trên một mặt tấm kính, chất dẻo hay kim loại. Bản thân lớp mỏng có thể là pha tĩnh hoặc chỉ là chất mang (hay giá đỡ) để giữ pha tĩnh trên đó. Pha động là chất lỏng sẽ thấm và chạy trên lớp mỏng do tác động của lực mao dẫn và đôi khi cả trọng lực, điện thế.

- SKLM được dùng để phát hiện các chất trong hỗn hợp, thử độ tinh khiết của sản phẩm, được dùng nhiều trong các phòng thí nghiệm lâm sàng, trong nghiên cứu hoá, sinh.

- Nhanh (15 phút – 3 giờ)

- Để kết hợp định tính với định lượng, bán định lượng

- Tách tốt nhiều hỗn hợp phức tạp

Trong SKLM, bột rải lớp mỏng thường là loại bột rất mịn chất hấp phụ. các chất hấp phụ thường dùng là:

- Silicagel loại hạt qua rây cỡ lỗ 0,07-0,10 mm.

- Nhôm oxyd (alumina)

- Loại bột có thêm bột bó (thạch cao ngậm 1,5 H[sub]2[/sub]O) là chất kết dính, có ký hiệu chữ G, loại có chỉ thị huỳnh quang có chữ F (ví dụ silicagel GF254).

SKLM thường được tiến hành trên một bản thuỷ tinh hay chất dẻo có rải một lớp mỏng các hạt bột mịn dính chắc trên đó. Lớp mỏng này thường được dùng làm pha tĩnh. Các pha tĩnh và động trong SKLM cũng tương tự các pha dùng trong các sắc ký lỏng hiệu năng cao (sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố pha thuận và pha ngược, sắc ký trao đổi ion, sắc ký trên gel). Bản mỏng có thể tự rải lấy, nhưng ngày nay thường dùng loại bản mỏng tráng sẵn.

Dung môi phải là loại tinh khiết, thường dùng hỗn hợp 2-3 các dung môi. Các dung môi xếp theo thứ tự mạnh dần (sức đẩy, phản hấp phụ): hexan, heptan, cyclohexan, carbon tetraclorid, benzen, cloroform, butyl acetat, ethet, ethyl acetat, pyridin, aceton, ethanol, methanol, nước.

Có thể là bình chuyên dụng hoặc các lọ rộng miệng, ống hình trụ, có nắp

3. Tiến hành

3.1. Chuẩn bị

- Chuẩn bị bản mỏng và bình săc ký thích hợp

- Chuẩn bị dung môi: cho dung môi vào bình, quanh thành bình lót giấy lọc để bão hoà dung môi được nhanh hơn. Nếu tiến hành sắc ký phân bố thì chuẩnbị dung môi và bình như với sắc ký giấy (Hỗn hợp dung môi tự tách làm hai lớp, lớp pha động cho vào đáy bình, lớp pha tĩnh cho vào 1 cốc đặt vào bình).

3.2. Chấm dung dịch lên bản mỏng

Kẻ một vạch thẳng nằm ngang bằng bút chì, cách mép dưới của bản mỏng 1 cm làm vạch xuất phát. Dùng mao quản hay micropipet chấm các vết dung dịch thử và dung dịch chuẩn lên đó. Các vết phải cách nhau và cách mép bản mỏng ít nhất 1 cm.

3.3. Khai triển sắc ký:

Là quá trình cho pha động chạy, kéo mẫu phân tích di chuyển trên pha tĩnh. Đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hoà hơi dung môi của pha động, mép phía chấm mẫu được nhúng vào dung môi động nhưng không được cho điểm đã chấm mẫu chạm trực tiếp vào dung môi động. Sau khi dung môi chạy được nửa hay hai phần ba bản mỏng ta lấy ra để khô hay sấy khô.

4. Đọc kết quả

MỤC ĐÍCH SỬ DỤNG

Kit thử phát hiện sử dụng chất gây nghiện MOP là dụng cụ xét nghiệm sắc ký miễn dịch định tính phát hiện sự có mặt của Morphine trong nước tiểu với ngưỡng 300 ng/ml. Kit thử này sẽ phát hiện được các hợp chất khác (xem thêm ở bảng dưới)

Kỹ thuật này chỉ cung cấp kết quả phân tích ban đầu. Cần phải làm thêm các phương pháp hóa học khác, đặc hiệu hơn để khẳng định kết quả (phương pháp sắc ký khí / sắc ký khối phổ GC/MS). Nên xem xét lại lâm sàng và quyết định chuyên môn đối với bất kỳ kết quả nào phát hiện thuốc gây nghiện, đặc biệt khi kết quả xét nghiệm dương tính.

Các thuốc giảm đau gây nghiện gồm một nhóm lớn các chất kiểm soát đau bằng cách ức chế hệ thần kinh trung ương. Liều Morphine cao có thể tạo ra mức độ say thuốc và lệ thuộc thuốc cao hơn cho người sử dụng, dẫn đến tình trạng nghiện. Morphine được bài tiết ở dạng không chuyển hoá và cũng là chất chuyển hóa chủ yếu của codeine và heroine. Morphine có thể được phát hiện trong nước tiểu vài ngày sau khi dùng liều thuốc gây nghiện.

Kit thử phát hiện sử dụng chất gây nghiện MOP trong nước tiểu là kit thử phát hiện nhanh , không cần dùng thiết bị nào. Kit thử dùng kháng thể đơn dòng phát hiện một cách chọn lọc mức độ gia tăng MOP trong nước tiểu. Kit thử phát hiện sử dụng chất gây nghiện MOP trong nước tiểu cho kết quả dương tính khi nồng độ Morphine trong nước tiểu đạt 300 ng/ml. Ngưỡng dương tính này được tổ chức SAMHSA, USA đề nghị.

NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG

Kit thử phát hiện sử dụng chất gây nghiện MOP trong nước tiểu là xét nghiệm sắc ký miễn dịch dựa vào nguyên lý của phản ứng cạnh tranh. Thuốc hiện diện trong mẫu nước tiểu cạnh tranh với liên hợp thuốc ở những vị trí gắn kết kháng thể. Trong quá trình xét nghiệm, mẫu nước tiểu thấm lên trên dọc theo màng thấm kít thử nhờ mao dẫn. MOP, nếu có mặt trong nước tiểu với nồng độ thấp hơn 300 ng/ml, sẽ không thể bão hòa các vị trí gắn kết của những phần tử phủ kháng thể trên kit thử. Những phần tử này sẽ bị bắt giữ sau đó bởi liên hợp MOP bất động và hình thành vạch màu trên vùng kết quả. Vạch màu không được hình thành trên vùng kết quả nếu mức độ MOP trên 300 ng/ml vì nó bão hòa được tất cả các vị trí gắn kết của kháng thể kháng MOP. Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, một vạch màu luôn luôn xuất hiện tại vùng chứng (gọi là vạch chứng) để chứng tỏ rằng lượng mẫu đã đủ và lớp màng đã thấm tốt.

THÀNH PHẦN CHÍNH:

Kit thử chứa phần tử phủ cặp kháng thể kháng MOP đơn dòng chuột và liên hợp protein – MOP. Kháng thể dê được dùng trên vạch chứng.

CẢNH BÁO VÀ PHÒNG NGỪA

BẢO QUẢN VÀ ĐỘ ỔN ĐỊNH

Kit thử có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc làm lạnh (2 – 30oC). Kit thử giữ được tính ổn định cho đến ngày hết hạn sử dụng in trên túi đựng sản phẩm. Kit thử phải được bảo quản trong túi hàn kín cho đến khi lấy ra sử dụng. Không được làm đông băng sản phẩm. Không sử dụng kit thử quá hạn dùng.

LẤY VÀ CHUẨN BỊ MẪU BỆNH PHẨM

Kỹ thuật lấy mẫu nước tiểu:

Mẫu nước tiểu phải được để trong lọ chứa khô và sạch. Có thể lấy nước tiểu vào bất kỳ thời điểm nào trong ngày. Mẫu nước tiểu có cặn cần phải được quay ly tâm, lọc và để lắng, lấy phần nước tiểu trong để xét nghiệm.

Lưu trữ mẫu:

Mẫu nước tiểu có thể lưu trữ ở 2 – 8oC trong 48 giờ trước khi xét nghiệm. Nếu lưu trữ lâu hơn, mẫu nuớc tiểu có thể làm đông và lưu trữ ở nhiệt độ dưới -20oC. Mẫu nước tiểu đông phải được làm tan ra và trộn đều trước khi xét nghiệm.

- Các kit thử

- Hướng dẫn sử dụng.

- Dụng cụ đựng mẫu bệnh phẩm.

- Thiết bị đo thời gian.

HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG:

Để kit thử, mẫu nước tiểu…ở nhiệt độ phòng (15 – 30OC)

trước khi làm xét nghiệm.

1. Lấy kit thử ra khỏi túi kín đựng sản phẩm và sử dụng kit thử càng nhanh càng tốt. Để đạt kết quả tốt nhất, toàn bộ quá trình xét nghiệm phải được hoàn thành trong vòng một giờ kể từ khi mở túi đựng sản phẩm.

2. Nhúng que thử theo chiều mũi tên hướng xuống mẫu nước tiểu, ít nhất 10 – 15 giây. Không nhúng quá vạch MAX trên que thử (Xem hình minh họa).

3. Đặt que thử trên mặt phẳng nằm ngang, không thấm nước, bắt đầu tính thời gian và đợi vạch đỏ xuất hiện. Kết quả nên đọc trong vòng 5 – 10 phút. Không đọc kết quả sau 10 phút.

ĐỌC VÀ DIỄN GIẢI KẾT QUẢ (Xem hình minh họa)

Alcaloid độc của Lá ngón( koumin, kouninidin, kouminin, kouminixin) và Mã tiền( Strichnin, Brucin) trong các mẫu thử được chiết tách từ cắn B qua các phản ứng màu, sắc ký lớp mỏng, đo quang phổ UV, phản ứng sinh vật để xác định.

2. Quy trình kỹ thuật:

2.1 Chuẩn bị:

- Dụng cụ: Bát sứ, đũa thuỷ tinh, Bản mỏng Silicagel G hoặc 60GF254, Bình triển khai sắc ký, đầu côn nhỏ, đầu phun sương, quả bóp, máy sấy, máy đo UV, bơm tiêm 1mL.

- Hoá chất: Acid sulfuric đặc, tinh thể Kali bicromat, Toluen, Aceton, Ethanol, Amoniac, H[sub]2[/sub]SO[sub]4[/sub] 10%, Dragendoff…

- Động vật: Chuột nhắt trắng

- Mẫu thử: Mẫu thử được chiết theo quy trình chung bằng Cloroform.

2.2.1 Phản ứng màu:

- Cho vào bát sứ 2-3 giọt cặn chiết B, sấy khô. Thêm vào 1 giọt acid sulfuric đặc và 1 hạt tinh thể kalibicromat. Dùng đũa thuỷ tinh di nhẹ tinh thể Kali bicromat qua vùng có Acid Sulfuric. Xuất hiện màu tím( chú ý quan sát ngay)

- Cho vào bát sứ 2-3 giọt cặn chiết B, sấy khô. Thêm vào 2-3 giọt acid Nitric đặc, xuất hiện màu đỏ thẫm ( Brucin) chuyển dần sang da cam rồi vàng.

- Pha dung môi khai triển Toluen- Aceton- Ethanol- Amoniac với tỉ lệ tương đương 45:45:7:3 lắc đều rồi đổ vào bình triển khai( chú ý đổ 1 lượng không quá 1cm chiều cao trong bình triển khai) đậy nắp lại để dung môi hoà trộn đều trước khi đặt bản sắc ký vào ít nhất 15 phút.

- Dùng đầu côn nhỏ chấm khoảng 15µL mẫu thử lên bản mỏng. Đồng thời chấm mẫu chuẩn đối chiếu cách mẫu thử khoảng 1cm. Chú ý chấm cách mép dưới bản mỏng khoảng 1cm và vết chấm càng gọn càng tốt, vừa chấm ta vừa sấy khô.

- Đặt bản mỏng vào trong bình triển khai đã có sẵn dung môi ở trên. Chờ dung môi ngấm dần lên tới khi cách mép trên 1cm ta nhấc bản mỏng ra. Có thể để khô tự nhiên hoặc sấy khô.

- Soi qua đèn tử ngoại để nhận biết sơ bộ.

- Phun thuốc thủ hiện màu là Dragendoff bằng đầu phun hơi sương. Sau đó tăng độ nhậy bằng acid sulfuric 10%.. Để khô tự nhiên hoặc sấy khô.

Kết quả: Mẫu thử là Lá ngón cho 4 vết màu vàng trên bản mỏng và có Rf tương đương với mẫu chuẩn. Mẫu thử là mã tiền có 2 vết màu vàng cam trên bản mỏng và có Rf tương đương với mẫu chuẩn.

- Cách 1: Lấy cặn chiết B đem hoà tan vào Ethanol( có thể lọc qua giấy lọc) đo quang phổ UV- VIS.

Kết quả: + Mã tiền cho 2 đỉnh phổ cực đại tại 256nm và 264nm

+ Lá ngón cho 4 đỉnh phổ cực đại.

- Cách 2: Chạy sắc ký bản mỏng của cặn chiết B sau đó sấy khô, soi đèn tử ngoại dùng bút chì xác định các vết. Cạo các vết này ra hoà tan vào Ethanol lọc qua giấy lọc sau đó đo quang phổ UV-VIS. Các đỉnh hấp thụ sẽ tương ứng cho từng Alcaloid.

2.2.4 Thử phản ứng trên sinh vật.

Cặn chiết B được hoà tan vào 0,5-1mL nước cất sau đó điều chỉnh về pH trung tính bằng acid sulfuric 10%.

Tiêm 0,5 mL vào dưới da cho chuột nhắt trắng. Chuột chết với các triệu chứng ngộ độc như sau:

- Ngộ độc lá ngón: Co giật, mắt lồi, chân duỗi thẳng.

- Ngộ độc mã tiền: Sợ tiếng động, co giật tăng dần, co cứng, chết do ngạt thở.

Mẫu thử phải dương tính với các phương pháp trên mới có thể kết luận. Ngoài ra hiện nay để kết quả đạt độ chính xác cao và xác định được hàm lượng ta dùng kỹ thuật phân tích trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao có gắn khối phổ( HPLC-MS)

- Phân loại được các loại mẫu trong phân tích giám định

- Trình bày được cách phân chia mẫu trong phân tích giám định độc chất

- Cách sử lý mẫu phân tích chất độc bay hơi

- Cách sử lý mẫu phân tích chất độc hữu cơ.

- Cách sử lý mẫu phân tích chất độc vô cơ.

Mẫu thử trong KNĐCPY thường rất đa dạng và phức tạp: Về chủng loại chúng có thể là các mẫu phủ tạng(người hoặc động vật) ,các dịch sinh lý như : máu, nước tiểu,chất nôn, dịch dạ dày hoặc chất chứa trong dạ dày, dịch não tuỷ.v.v...Các phần cứng hoặc sừng hoá như xương, lông, móng, tóc.v.v...Đều là đối tượng trong KNĐCPY

Các tang vật kèm theo mẫu phủ tạng cũng rất đa dạng và phức tạp, chúng thường là: Đồ ăn, thức uống nghi ngờ có chất độc hoặc gói hoá chất, Viên thuốc, đất cát, thân, rễ, lá, hoa, quả, hạt của cây có hoặc nghi ngờ có chất độc hoặc các vật dụng thường ngày nghi ngờ có hoặc bị nhiễm chất độc. Ngoài ra còn một số chất khí độc có sẵn trong thiên nhiên, nhân tạo hoặc sinh ra trong quá trình liên kết hay phản ứng hoá học, phân rã tự nhiên do độ ẩm, nhiệt độ, không khí môi trường.v.v...

Yêu cầu phải gửi ít nhất là 300gam mới đủ để tiến hành PTGĐ, chỉ cần bác sĩ pháp y chú ý lấy đủ và chú ý lấy các bộ phận mà chất độc tích luỹ nhiều nhất trong cơ thể.

Ví dụ:

- Nếu nghi ngờ nạn nhân bị ngộ độc và tử vong do một loại chất độc nào đó thì phải xem xét tới tính chất sinh hoá, lí hoá của chất độc đó và lấy nơi phủ tạng có chứa nhiều nhất loại chất độc nghi ngờ.

- Nếu nghi ngờ nạn nhân tử vong do bacbiturat thì phải lấy não, chất chứa dạ dày, gan và máu.

- Nếu nghi ngờ nạn nhân tử vong do cyanid hoặc ancaloid của cây lá ngón thì phải lấy máu , gan và chất chưá dạ dày.

- Số lượng: Tuỳ thuộc vào cơ quan điều tra thu giữ được bao nhiêu thì gửi bấy nhiêu, tuỳ theo số lượng gửi tới và tính chất của từng loại mà ta quyết định sử dụng một phần hay toàn bộ để tiến hành PTGĐ.

- Nếu không có yêu cầu cụ thể ghi trong quyết định trưng cầuPTGĐ là những mẫu vật mà không được phá huỷ trong quá trình PTGĐ thì KNV có quyền phá huỷ mẫu vật đó trong quá trình PTGĐ

- Khi tiến hành PTGĐ xong phải lưu giữ những mẫu vật (nếu còn đủ điều kiện có thể lưu giữ được) theo đúng quy trình lưu giữ các mẫu tang vật để khi cần thiết tái giám định.

- Do tính chất đa dạng và phức tạp của các mẫu tang vật nên tuỳ từng loại mà ta có hướng để PTGĐ các chất độc khác nhau. Đôi khi có thể tiến hành PTGĐ mở rộng.

Ví dụ:

- Nếu mẫu tang vật là cây cỏ thì ta phân tích các Ancaloid, Glycozid hoặc có các loại thuốc trừ sâu có trong đó.

- Nếu mẫu tang vật là gói bột màu trắng có mùi hắc (hạnh nhân),dễ tan trong nước và có pH rất kiềm thì có thể hướng tới các muối Cyanid (NaCN hoặc KCN.v.v...) thường dùng để đãi vàng sa khoáng hoặc trong công nghệ mạ kim loại v.v...

- Cũng có thể tuỳ hoàn cảnh địa lí các vùng khác nhau của đất nước (thành thị, nông thôn, miền núi.v.v...) mà suy luận và hướng tìm các loại chất độc khác nhau. Ví dụ: Các thành phố lớn thường gặp các thuốc an thần, gây ngủ còn nông thôn và miền núi thường gặp thuốc trừ sâu, diệt cỏ hoặc Ancaloid của cây lá ngón, hạt mã tiền v.v...

Quy trình xử lý mẫu và phân tích từng loại tang vật để tìm các chất độc cụ thể, được phân tích theo quy trình PTGĐ các chất độc đã có hướng phân tích theo từng chuyên luận riêng biệt.

Mẫu phủ tạng(người hoặc súc vật) được lấy từ nơi bảo quản lạnh, các KNV nhận xét hình thức đóng gói, niêm phong, số lượng chai lọ được đóng gói, nhãn mác ghi bên ngoài (nếu có) . Tất cả phải được ghi vào sổ tay KNV.

Mở bao gói, đổ toàn bộ phủ tạng ra bát thép không gỉ (hoặc bằng sứ hoặc bằng thuỷ tinh) ghi nhận xét mẫu gửi tới gồm những bộ phận phủ tạng gì, cân tổng số hoặc cân riêng từng loại, xem xét kĩ mẫu phủ tạng gửi tới có gì đặc biệt không.ví dụ: Bột màu đen trong chất chứa dạ dày gợi ý cho ta nạn nhân có thể bị đầu độc hoặc tự sát bằng kẽm phosphid, bột màu trắng hoặc mảnh vỡ của viên thuốc có thể nghĩ tới các loại thuốc tân dược, mùi hạnh nhân có thể gợi ý tìm cyanid, mùi hắc đặc biệt có thể lưu ý tìm các thuốc trừ sâu diệt cỏ, mảnh vụn của lá cây hướng tới các loại cây độc như lá ngón.v.v...

Toàn bộ phủ tạng và chất chứa trong dạ dày được cắt hoặc xay nhỏ và được phân chia như sau:

- Nếu số lượng phủ tạng ³ 300ghủ tạng được chia làm 04 phần để lần lượt phân tích tìm:

+01 phần phân tích tìm chất độc bay hơi.

+01 phần phân tích tìm chất độc hữu cơ.

+01 phần phân tích tìm chất độc vô cơ.

+01 phần lưu trữ để khi cần thiết phân tích lại hoặc tái giám định khi có yêu cầu của cơ quan điều tra.

- Nếu số lượng mẫu phủ tạng từ 150g®300g:chia 03 phần để phân tích như trên, không có mẫu để lưu.

- Nếu số lượng mẫu phủ tạng <150g: chia 02 phần:

+01 phần để tìm chất độc bay hơi, bã còn lại để vô cơ hoá tìm các chất độc vô cơ.

+01 phần để phân tích tìm các chất độc hữu cơ.

- Nếu số lượng mẫu phủ tạng gửi tới rất ít (thường<50g): Tiến hành phân tích tìm các chất độc bay hơi, bã được ngâm cồn và acid tactric tới pH=4-5,lọc, loại Albumin, chiết xuất liên tiếp ở 2 môi trường acid và kiềm để tìm chất độc hữu cơ, bã và giấy lọc vô cơ hoá để tìm chất độc vô cơ.

KNV có quyền từ chối phân tích, giám định khi nhận thấy mẫu phủ tạng hoặc các tang vật gửi tới không đủ điều kiện để phân tích, giám định. (Trích điều 44 luật tố tụng hình sự).

3.2.2. Phân chia mẫu phủ tạng để PTGĐ khi có hướng :(Có chỉ dẫn cụ thể của cơ quan điều tra và bác sĩ pháp y hoặc cuả các Tổ chức giám định pháp y ở TW hoặc các địa phương).

Phủ tạng cũng được cắt hoặc xay nhỏ chia 02 phần:

- 01 phần để phân tích theo hướng đã được chỉ dẫn của cơ quan điều tra hoặc bác sĩ pháp y theo qui trình riêng biệt phân tích giám định các chất độc trong từng chuyên luận cụ thể:

+Phân tích tìm chất độc bay hơi.

+Phân tích tìm chất độc hữu cơ.

+Phân tích tìm chất độc vô cơ.

- 01 phần để lưu mẫu khi cần phân tích mở rộng, phân tích lại hoặc tái giám định khi có yêu cầu.

4. Phân tích phát hiện các chất độc bay hơi khi không có hướng không có chỉ dẫn cụ thể của cơ quan trưng cầu giám định).

Chuẩn bị bộ cất kéo hơi nước: Rửa sạch các ống dẫn hơi bằng hơi nước nóng, bình sinh hơi nước đã được đun sôi từ trước.

Chuẩn bị bình hứng: 02 bình nón có nắp mài, đánh số 1 & 2 dung tích 100ml bên trong có sẵn 5 ml nước cất đã được kiềm hoá trước tới pH=9-10 bằng NaOH hoặc KOH 30% và 01 bình hứng có sẵn 10ml nước Brom bão hoà. Tất cả bình hứng khi tiến hành hứng dịch cất được đặt trong 01 bát sứ có sẵn đá cục để làm lạnh.

4.2.1. Mẫu thử là phủ tạng (Người hoặc súc vật): Phủ tạng khoảng 100gam được cắt nhỏ hoặc xay nhỏ cho vào bình cất có dung tích thích hợp (thường là 500ml), thêm 50ml nước để tạo thành hỗn hợp đặc sệt, lắc đều. Thêm 5ml Acid sulfuric 10% lắc nhẹ và lắp ngay vào bộ cất kéo hơi nước đã chuẩn bị sẵn

Làm nóng đều bình đựng mẫu lên từ từ rồi tăng mạnh nhiệt độ bình sinh hơi để cho hơi nước sục mạnh vào bình đựng mẫu

Hứng trực tiếp vào bình hứng số1 từ 15-20 ml dịch cất đầu tiên, chia 3 phần để sơ bộ tìm:

-5ml dịch cất để tìm rượu

-5ml dịch cất để tìm Cyanid.

-5ml dịch cất để tìm Clo hữu cơ

Nếu một trong các phản ứng nêu trên dương tính thì ta tiến hành phân tích các chất đó ở bình hứng số 2

Hứng tiếp 50-100ml dịch cất bay hơi vào bình hứng thứ 2.

*Chú ý:-Trong quá trình cất, nếu thấy dịch hứng trong kiềm ở bình hứng số 1 hoặc số 2 có màu vàng chanh thì ta hướng vào phân tích tìm các thuốc trừ sâu có gốc Paranitrophenol (Wofatox, Parathion).

- Nếu phản ứng tìm Clo hữu cơ (thuỷ phân bằng HNO[sub]3[/sub] và tìm Cl[sup]-[/sup] bằng AgNO[sub]3[/sub]) dương tính, hướng ta vào phân tích tìm các thuốc trừ sâu có Cl[sup]-[/sup] như DDT, 666, Cypermethrin....

- Nếu phản ứng tìm rượu hoặc CN[sup]-[/sup] dương tính, tốt nhất là có mẫu máu hoặc ta sẽ tiến hành phân tích lại ở mẫu phủ tạng dự trữ.

- Nếu có nghi ngờ nạn nhân bị ngộ độc do Kẽm phosphid thì hứng dịch cất bay hơi vào bình nón thứ 3 đã chuẩn bị ở trên có sẵn 10ml dung dịch nước Brom bão hoà. Hứng cho tới khi dịch cất nhỏ xuống không làm mất màu vàng của nước Brom bão hoà tức là lúc kết thúc quá trình cất. Lấy dịch cất được cô bớt trên bát sứ để giảm thể tích và đuổi hết Brom thừa (hết màu vàng) và tiến hành tìm phosphat bằng thuốc thử Nitromolipdic.

Tuỳ tính chất cụ thể của từng tang vật và số lượng mẫu tang vật do cơ quan điều tra thu giữ được mà ta chọn lựa phương pháp sử lý và phân tích thích hợp.

Ví dụ: -Giấy Picrosode phát hiện Cyanid

-Test tạo màu xanh lam phổ phát hiện Cyanid.

-Giấy tẩm HgCl[sub]2[/sub] phát hiện PH[sub]3[/sub](Phosphid hydro)...

Phủ tạng được cắt hoặc xay nhỏ, ngâm cồn Ethanol và Acid tartric (dung dịch Acid tactric 30%trong Ethanol) tới pH=4®5 trong 1 bình nón nắp màimiệng rộng có dung tích thích hợp (500ml), đậy kín,để qua đêm (khoảng 24 giờ).Lọc bằng giấy lọc gấp nếplấy dịch lọc,cô trên cách thuỷ tới dạng sền sệt như sirô, để nguội. Dùng đũa thuỷ tinh khuấy nhẹ, vừa khuấy vừa cho thêm cồn Ethanol 96° tới khi không còn thấy tủa Anbumin màu trắng đục, lọc qua giấy lọc gấp nếp,lấy dịch lọc và tiếp tục loại anbumin như trênthêm 1 hoặc 2 lần nữa đến khi nhỏ 1 giọt cồn Ethanol vào dịch cô đặc không thấy tủa màu trắng xuất hiện là việc loại Anbumin đã hoàn thành (chú ý quá trình trên phải thử và điều chỉnh pH môi trường để dịch lọc lúc nào cũng có pH=4à5).Dịch cô đặc trên được hoà vào 40à50 ml nước cất(có thể lọc qua giấy lọc),dung dịch nước ở pH =4à5 trên được chiết xuất bằng 20nl Ether dầu hoả 1-2 lần để loại mỡ và các tạp chất tương tự ra khỏi dịch lọc. Bỏ lớp Ether dầu hoả,lớp nước trên được chiết xuất liên tiếp ở môi trường acid (pH =4à5) và môi trường kiềm (pH =9à10) bằng các dung môi hữu cơ thích hợp (Ether hoặc Cloroform v.v..).Cô trên cách thuỷ đến cắn khô ta được cắn chiết ở 2 môi trường acid và kiềm. Cắn này dùng để phân tích tìm các chất độc hữu cơ.( theo sơ đồ 2).